掌握哺乳動(dòng)物源性成分探針法PCR熒光定量試劑盒的完整設(shè)置流程，覆蓋體系配制、程序參數(shù)、儀器操作等全環(huán)節(jié)規(guī)范，保障擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)順利完成。

一、20μL反應(yīng)體系設(shè)置

?組分添加順序?：按照無酶水→緩沖液→dNTP→引物與探針→模板→Taq酶的順序加樣，降低酶失活概率。

?預(yù)混液配制?：多樣本實(shí)驗(yàn)可先配制Master Mix預(yù)混液，分裝后再加入對(duì)應(yīng)模板，減少加樣誤差。

?體系質(zhì)控?：加樣后輕彈管底混勻，3000rpm短暫離心10秒，確保管內(nèi)無殘留氣泡。

二、儀器程序設(shè)置

?基礎(chǔ)擴(kuò)增循環(huán)?：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性10秒，55-60℃退火延伸30秒，共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。

?熒光采集設(shè)置?：在退火延伸階段采集FAM通道熒光信號(hào)，Passive Reference選擇None模式，適配多數(shù)國產(chǎn)儀器。

?實(shí)驗(yàn)屬性配置?：在儀器軟件中新建實(shí)驗(yàn)，設(shè)置實(shí)驗(yàn)類型為絕對(duì)定量/定性檢測，標(biāo)記對(duì)應(yīng)樣本孔位與標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度。

三、對(duì)照體系設(shè)置

定量實(shí)驗(yàn)需設(shè)置6個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線孔、PCR陰性對(duì)照孔、樣本制備陰陽對(duì)照孔。

定性實(shí)驗(yàn)僅需保留1個(gè)陽性對(duì)照梯度孔，其余對(duì)照體系保持不變。

四、設(shè)置后校驗(yàn)

確認(rèn)所有管蓋蓋緊，程序參數(shù)核對(duì)無誤后，將PCR管放入儀器樣品槽，啟動(dòng)擴(kuò)增運(yùn)行。