大鼠脈絡(luò)膜血管細胞（原代培養(yǎng)，以微血管內(nèi)皮細胞為主）的標準培養(yǎng)方法，核心是?酶消化法分離+選擇性純化?，具體操作流程如下：

一、培養(yǎng)前準備

?試劑包被?：配制0.1%明膠溶液，包被培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)板，室溫放置2小時后吸去多余液體，超凈臺晾干備用；提前將培養(yǎng)基（DMEM/F12 + 15%胎牛血清 + 1%雙抗 + 10ng/mL VEGF ）37℃水浴預(yù)溫。

?消毒處理?：超凈臺紫外線消毒30分鐘，解剖器械高壓滅菌，75%酒精消毒臺面。

二、脈絡(luò)膜組織取材

脫頸處死成年SD大鼠（8-12周齡，雄性更佳），75%酒精浸泡全身消毒5分鐘。

快速摘除眼球，放入預(yù)冷的含1%雙抗的PBS緩沖液中清洗干凈。

體視顯微鏡下剪開眼球，去除角膜、晶狀體和視網(wǎng)膜，小心分離出脈絡(luò)膜層（棕褐色薄膜層），收集到無菌離心管中。

三、酶消化分離細胞

吸去PBS，將脈絡(luò)膜組織剪碎至1mm3大小的碎塊，加入0.1%Ⅱ型膠原酶（每100mg組織加1mL），37℃水浴振蕩消化30分鐘，每10分鐘輕輕混勻一次。

消化結(jié)束后，加入2mL培養(yǎng)基終止消化，用玻璃移液管輕輕吹打5分鐘，打散組織塊。

用200目細胞篩過濾，去除未消化的組織塊，濾液1000rpm室溫離心5分鐘，棄上清。

四、選擇性純化脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細胞

利用?差速貼壁法?去除成纖維細胞雜細胞：

用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，接種到明膠包被的T25培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

培養(yǎng)30分鐘后，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，吸出未貼壁的細胞懸液（內(nèi)皮細胞貼壁慢，成纖維細胞已經(jīng)貼壁），轉(zhuǎn)移到新的明膠包被培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

24小時后全量換液，去除未貼壁的死細胞和雜細胞，之后每2天換液一次。

也可結(jié)合CD31免疫磁珠分選，獲得純度95%以上的內(nèi)皮細胞，適合對純度要求高的實驗。

五、傳代與凍存

?傳代?：細胞匯合度達到80%-90%即可傳代，0.25%消化1分鐘，終止后按1:2比例傳代，原代細胞傳代不超過5代，超過后細胞形態(tài)會發(fā)生改變。

?凍存?：取P2-P3代對數(shù)生長期細胞，用凍存液（90%胎牛血清 + 10%DMSO）重懸，梯度降溫后放入液氮長期保存。

關(guān)鍵注意事項

分離脈絡(luò)膜時必須去除干凈視網(wǎng)膜，避免視網(wǎng)膜色素上皮細胞污染；

添加VEGF能促進內(nèi)皮細胞增殖，顯著提升原代細胞存活率；

大鼠脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細胞增殖較慢，換液不要過于頻繁，每2天一次即可。