小鼠原代下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)無菌、操作輕柔度和培養(yǎng)基要求很高，標(biāo)準(zhǔn)操作流程如下：

一、培養(yǎng)前準(zhǔn)備

?試劑預(yù)配預(yù)溫?：配制預(yù)冷的解剖液（DMEM/F12 + 10mM HEPES + 1%雙抗）、0.25%、種植培養(yǎng)基、維持培養(yǎng)基（Neurobasal + 2%B27 + 1%GlutaMAX + 1%雙抗），所有使用前放入37℃水浴預(yù)溫。

?包被培養(yǎng)板?：用0.1mg/mL多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)板，室溫包被過夜后，用無菌PBS沖洗3次，超凈臺(tái)內(nèi)晾干備用，避免神經(jīng)元貼壁不良。

?環(huán)境消毒?：超凈臺(tái)紫外線消毒30分鐘，手術(shù)器械提前高壓滅菌，75%酒精消毒臺(tái)面。

二、腦組織取材（孕14-16天小鼠胚胎，神經(jīng)元活性最佳）

脫頸處死孕鼠，75%酒精消毒腹部皮膚，剖開腹腔取出子宮，放入預(yù)冷的無菌解剖液中。

剪開子宮壁取出胚胎，分離出完整腦組織，轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷解剖液中。

體視顯微鏡下剝離腦膜，準(zhǔn)確分離出下丘腦區(qū)域，收集組織塊到離心管。

三、組織消化與細(xì)胞分離

吸去多余解剖液，加入0.25%（每100mg組織加1mL），37℃水浴消化15分鐘，每5分鐘輕輕晃動(dòng)一次。

消化結(jié)束后，吸出，加入5mL種植培養(yǎng)基終止消化，再用種植培養(yǎng)基清洗2次去除。

用口徑漸小的玻璃移液管輕輕吹打組織塊，直到形成均勻細(xì)胞懸液，靜置2分鐘讓未消化的組織塊沉淀。

吸取上層細(xì)胞懸液，200目細(xì)胞篩過濾，1000rpm室溫離心5分鐘，棄上清。

用種植培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞密度到1×10^6個(gè)/mL。

四、接種與培養(yǎng)

將細(xì)胞懸液接種到提前包被好的培養(yǎng)板/瓶，輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞均勻分布，放入37℃、5%CO?飽和濕度培養(yǎng)箱。

接種24小時(shí)后，全量更換為維持培養(yǎng)基，去除未貼壁的死細(xì)胞和雜細(xì)胞。

之后每3天半量換液：吸出一半舊培養(yǎng)基，加入等量新鮮維持培養(yǎng)基，避免沖擊貼壁的神經(jīng)元。

五、凍存（備用儲(chǔ)存）

培養(yǎng)7-10天，神經(jīng)元成熟狀態(tài)最佳時(shí)，用輕輕消化收集細(xì)胞。

用凍存液（90%胎牛血清 + 10%DMSO）重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為1×10^6~2×10^6個(gè)/mL，分裝到凍存管。

放入異丙醇梯度降溫盒，-80℃過夜后轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存。

關(guān)鍵注意事項(xiàng)

取材全程保持低溫，操作盡量在冰上進(jìn)行，避免神經(jīng)元缺氧死亡；

吹打組織時(shí)動(dòng)作輕柔，避免過度吹打?qū)е律窠?jīng)元機(jī)械損傷，降低存活率；

必須使用無血清的神經(jīng)元維持培養(yǎng)基，添加B27添加劑，抑制膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖。