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細胞凍存是一種將細胞在極低溫度下保存的方法,以最大限度地減少細胞損傷并保持其活性,以便未來能夠復(fù)蘇和使用。細胞凍存的基本步驟:
1.配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液;
2.取對數(shù)生長期的細胞,去除舊培養(yǎng)液,用PBS清洗。
3.去除PBS,加入適量yi蛋白酶(覆蓋培養(yǎng)皿表面)把單層生長的細胞消化下來;
4.離心1000rpm,5min;
5.去除yi蛋白酶,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數(shù),調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml~1×107/ml;
6.將細胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml;
7.在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者;
8.凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/min;當溫度達-25℃以下時,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。
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