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實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作步驟

時(shí)間:2025/4/27閱讀:683
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實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作步驟:

1、RNA提?。?/p>

  針對(duì)莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)RT引物,RNA正常提取就好;對(duì)于Oligod(T)特異的RT引物,盡量用特殊試劑盒提取miRNA。

2、反轉(zhuǎn)錄:

  反轉(zhuǎn)錄過(guò)程對(duì)酶沒(méi)有特殊要求,操作按照反轉(zhuǎn)錄酶的說(shuō)明書進(jìn)行。對(duì)于引物,在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中只需加入Oligod(T)特異的RT引物或莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)RT引物,不需要另外添加其他RT引物。用Oligod(T)特異的RT引物時(shí),RNA需要進(jìn)行3'Poly(A)加尾處理。

  內(nèi)參基因不需要單獨(dú)設(shè)計(jì)RT引物,可以用熒光定量PCR的反向引物作為RT引物。

3、熒光定量PCR:

  先優(yōu)化PCR體系(引物濃度、退火溫度等),進(jìn)行引物測(cè)試,確保擴(kuò)增曲線正常且溶解曲線為單一的尖峰,陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增,則引物測(cè)試合格,再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(常規(guī)操作)。

   




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