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逆轉錄酶是存在于 RNA 病毒體內的依賴 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 實驗中的逆轉錄酶需要具有以下三種活性：
1. 依賴 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 為模板合成 cDNA 的第一條鏈；
2. Rnase 水解活性：水解 Rnase 雜合體中的 RNA;
3. 依賴 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以一條 DNA 鏈為模板合成互補的雙鏈 DNA
在選擇逆轉錄酶時，建議選擇無 RNaseH①活性（RNaseH-）的逆轉錄酶。具有 RNaseH 活性的逆轉錄酶的 RNaseH 活性會與聚合酶活性競爭 RNA 模板與 DNA 引物（或 cDNA 延伸鏈）形成的雜合鏈，并降解雜合鏈中的 RNA 鏈。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作為合成 cDNA 的有效底物，降低了 cDNA 合成的產量與長度。
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