水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫前處理試劑盒

水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫的快速測(cè)定方法

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T1768-2006）

1 原理

試樣中殘留的孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物用孔雀石綠、結(jié)晶紫快速檢測(cè)前處理試劑盒提供的試劑提取、用孔雀石綠柱濃縮凈化后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

2 試劑和材料

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

2.1乙腈：色譜純。

2.2無(wú)水乙酸銨。

2.3冰乙酸：色譜純。

2.4 乙腈酸溶液：乙腈+冰乙酸（98+2，V/V）。

2.5 甲醇酸溶液：甲醇+冰乙酸（80+20，V/V）。

2.6 乙腈水溶液：乙腈+水（20+80，V/V）。

2.7 5mmol/L乙酸銨緩沖溶液：稱取0.385 g無(wú)水乙酸銨，溶解于大約980 mL水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH到4.5，Z后用水定容到1000 mL，過(guò)0.20 µm濾膜。

2.8標(biāo)準(zhǔn)品: 孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫純度大于98 %。

2.9標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液:準(zhǔn)確稱取孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫各10mg，用乙腈分別溶解定容于100 mL容量瓶中，配制成100 µg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

2.10 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:用流動(dòng)相稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，配制成孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫均為10 µg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。0℃～4℃避光保存。

2.11孔雀石綠、結(jié)晶紫快速檢測(cè)前處理試劑盒* 。

3 儀器和設(shè)備

3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀:配有電噴霧(ESI)離子源。

3.2勻漿機(jī)。

3.3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

3.4離心機(jī)：4000 r/min。

3.5振蕩器。

3.6聲波水浴。

3.7聚四氟乙烯離心管:2.5 mL,50 mL，帶塞。

3.8微孔濾膜:0.45 µm。

4 測(cè)定步驟

4.1提取和凈化

提?。簻?zhǔn)確稱取已搗碎的樣品5.00 g于50 mL離心管中,先加入孔雀石綠、結(jié)晶紫快速檢測(cè)前處理試劑盒中的提取劑1^*(液體20.0 mL)，用勻漿機(jī)以8 000 r/min的速度均質(zhì)30 s，再加入提取劑2^*(固體粉末), 振蕩1 min,4 000 r/min離心5 min。

凈化：層析柱依次用2mL乙腈酸溶液(2.4)、5mL甲醇酸溶液（2.5）、5mL蒸餾水激活，再取上清液5mL于50mL試管中，加入10～15mL水混勻， 分次加入孔雀石綠層析柱中，用吸耳球從上口擠壓加快流速或用固相萃取機(jī)從下抽真空，液體流完后加5mL乙腈水溶液（2.6）洗滌，擠干柱中液體，用 0.8mL乙腈酸溶液（2.4）洗脫，收集洗脫液，用緩沖液（2.7）定容至1mL。微孔濾膜過(guò)濾，濾液供儀器測(cè)定。

4.2繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

移取孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫混和標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動(dòng)相稀釋成0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，得出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

4.3測(cè)定

4.3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

a) 色譜柱：C₁₈柱，150 mm×2.1 mm(i.d.)，粒度5 µm；

b) 流動(dòng)相：乙腈+5 mmol/L乙酸銨(75+25,V/V)；

c) 流速：0.2 mL/min；

d) 柱溫：35℃；

e) 進(jìn)樣量：10 µL；

f) 離子源：電噴霧ESI，正離子；

g) 掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；

h) 霧化氣、窗簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮?dú)?；使用前?yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到要求；

i) 噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應(yīng)優(yōu)化至*靈敏度；

j) 監(jiān)測(cè)離子對(duì)：孔雀石綠m/z 329/313（定量離子）、329/208；隱色孔雀石綠m/z 331/316（定量離子）、331/239；結(jié)晶紫m/z 372/356（定量離子）、372/251；隱色結(jié)晶紫m/z 374/358（定量離子）、374/238。

4.4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量測(cè)定

按照2.4.2.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定樣液中的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫含量。樣品中被測(cè)物殘留量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，如果含量出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)用流動(dòng)相適當(dāng)稀釋。在上述色譜條件下， 孔雀石綠 、結(jié)晶紫 、隱色孔雀石綠 、隱色結(jié)晶紫的保留時(shí)間約為1.89 min、5.35 min、2.47 min和5.51 min。標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜-電噴霧質(zhì)量色譜圖見(jiàn)附錄B中的圖B.1。

4.5液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性測(cè)定

按照2.4.2.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別計(jì)算樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中兩對(duì)離子對(duì)色譜峰面積的比值，僅當(dāng)兩者數(shù)值的相對(duì)偏差小于25%時(shí)方可確定兩者為同一物質(zhì)。

4.6空白試驗(yàn)

除不加試樣外，均按上述測(cè)定步驟進(jìn)行。

5結(jié)果計(jì)算表述

按式（1）分別計(jì)算供試樣品中的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱色結(jié)晶紫殘留量，計(jì)算結(jié)果需扣除空白。

4×c_i×V

ω = 　 …… (1)

m

ω－水產(chǎn)品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫或隱色結(jié)晶紫殘留量，µg/kg；

c_i －標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出試樣溶液中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱色結(jié)晶紫的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度，µg/L；

V－Z終定容體積數(shù)，mL；

4－換算常數(shù)；

m－供試試料樣品重量，g。

本方法分別計(jì)算孔雀石綠及代謝物隱色孔雀石綠,并分別報(bào)告孔雀石綠及代謝物隱色孔雀石綠結(jié)果。

本方法分別計(jì)算結(jié)晶紫及代謝物隱色結(jié)晶紫,并分別報(bào)告結(jié)晶紫及代謝物隱色結(jié)晶紫結(jié)果。

6測(cè)定低限、回收率

6.1測(cè)定低限

本方法孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫的檢測(cè)低限均為0.5 µg/kg。

6.2回收率

本方法孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫回收率均為:85%～105%；