實驗原理測定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有凱氏定氮法；比色法主要包括雙縮脲法、Folin-酚試劑法及 染料結(jié)合法；紫外分光光度法等雙縮脲(Biuret)法：在堿性溶液中，雙縮脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)與價銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含個或個以上酰胺基(—CO—NH2)，或與此相似的基團[如—CH2—NH2，—CS—NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，無論這類基團直接相連還是通過個碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵(—CO—NH—)，可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且呈色強度在定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定蛋白含量。與同樣處理的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較，經(jīng)計算或查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出血清總蛋白質(zhì)含量。實驗試劑1．6mol/L*溶液 稱取*(NaOH，純)240g，用新鮮蒸餾水配制成1L，置室溫貯存在密封的聚乙烯瓶里。2．雙縮脲試劑 稱取未失結(jié)晶水的硫酸銅(CuSQ·5H20) 3.0g，溶于500m1新鮮蒸餾水中，加酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6.4H2O)9.0g，(KI)5.0g，待安全溶解后，加入6mol/L*溶液100ml，后加蒸餾水至1L。室溫貯存在密閉的聚乙烯瓶里，約穩(wěn)定6個月。3．蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 可用商品血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或定值質(zhì)控血清為標(biāo)準(zhǔn)。亦可收集混合新鮮血清，用凱氏定氮法標(biāo)定后，加疊氮鈉防腐(疊氮鈉的終濃0.5~1.0g/L)，冰凍保存。實驗設(shè)備恒溫水浴箱、722（721）分光光度計、吸管、試管、坐標(biāo)紙實驗步驟1. 配制20g／L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 如蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為70g／L，則取此液2m1，加入新鮮蒸餾水5ml，混勻即成。2. 按表操作 加入物（ml） 空白管 1 2 3 4 5 測定管20g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 ～ 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ～ 蒸餾水 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 ～ 0.4待測樣品液體 ～ ～ ～ ～ ～ ～ 0.1雙縮脲試劑 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 相當(dāng)血液蛋白質(zhì)（g/L） ～ 20 40 60 80 100 混勻，置37℃水浴10min(或25℃30min)，用540nm波長比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制1—5為標(biāo)準(zhǔn)曲線管，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4. 實驗結(jié)果根據(jù)測定管吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查找相對應(yīng)的總蛋白濃度。 注意事項1．雙縮脲試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2 形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子，以防止CuSO4·5H20不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO4·5H20之比 不低于3：1，加入KI作為抗氧化試劑。2．雙縮脲試劑要封閉貯存．防止吸收空氣中的氧化碳。3．本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾乎不受溫度影響，唯缺點是靈敏度較低。4．黃疸血清．嚴(yán)重溶血對本法有明顯干擾。5．本法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線是條通過原點的直線，在100g/L濃度之內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
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