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多光子顯微鏡技術(shù)的突破

多光子顯微鏡無需染料或標簽即可進行3D高分辨率成像，改變了生物成像。這項技術(shù)的一個重要方面是使用非常短的飛秒脈沖。這些脈沖的使用有幾個優(yōu)點，使多光子顯微鏡成為研究生物樣品是有價值的工具。

1. 多光子顯微鏡使用飛秒脈沖減少了對樣品的光損傷。短脈沖限度地減少了曝光時間，減少了在成像過程中發(fā)生的光損傷量。這在活體樣本的研究中尤為重要，因為它允許研究人員在不影響樣本活力的情況下獲得高分辨率圖像。

肺組織的多光子顯微鏡圖像。阿姆斯特丹大學(xué)Groot Vrije教授有限公司

2. 使用飛秒脈沖提高了雙光子熒光的效率。這些脈沖的高峰值功率增強了非線性相互作用，從而提高了熒光效率。這使得研究人員可以用更少的光子獲得高分辨率的圖像，減少了對高激光功率的需求，并限度地減少了光損傷。

3. 此外，飛秒脈沖在多光子顯微鏡中提供了改進的空間分辨率。脈沖持續(xù)時間短，峰值功率高，可實現(xiàn)3D高分辨率成像，使研究人員能夠在細胞和亞細胞水平上研究樣品。

超短脈沖持續(xù)時間的優(yōu)勢:低于50fs

由于多光子激發(fā)的效率很大程度上取決于脈沖期間入射光的峰值功率，因此脈沖越短，峰值功率越高，產(chǎn)生的多光子信號就越強。到目前為止，產(chǎn)生低于80fs極限的超短潔凈脈沖的能力相對有限。

VALO fs激光系列提供了一種新的方法來克服這一限制，產(chǎn)生更短(低于50秒)和潔凈的脈沖。圖1顯示了雙光子和三光子效率與脈沖持續(xù)時間的關(guān)系[1,2]。多光子事件的效率與激光峰值功率呈非線性關(guān)系，對于兩個和三個光子過程，相應(yīng)的信號分別隨入射光峰值功率的平方和立方而增加。例如，將脈沖持續(xù)時間從200秒減少到50秒，峰值功率增加4倍，雙光子效率增加4倍，而三光子效率增加16倍。

圖1:二光子和三光子效率與脈沖持續(xù)時間的關(guān)系

然而，為了在實驗中應(yīng)用這種關(guān)系，必須準確地確定樣品中的脈沖持續(xù)時間。如果顯微鏡中的光學(xué)色散沒有得到適當(dāng)?shù)难a償，脈沖將被拉伸，并且在樣品上測量到較低的峰值功率。在這種情況下，脈沖持續(xù)時間與高次諧波產(chǎn)生效率之間的關(guān)系，無法通過實驗精確驗證。為了產(chǎn)生足夠的非線性SHG和THG信號，在對樣品溫和的平均功率水平下實現(xiàn)所需的信噪比，必須使用低于50 fs的脈沖和色散預(yù)補償。

圖2a)顯示了樣品在VALO fs系列激光器的全帶寬下，使用平均功率為4.7 mW的校準網(wǎng)格產(chǎn)生的三次諧波信號，產(chǎn)生~40 fs脈沖。在圖2b)中，激光的光譜帶寬被限制在10nm的FWHM，在1064 nm左右，產(chǎn)生~160 fs的脈沖。圖2a)和圖2b)的圖像比例相同，但圖2b)沒有THG信號。只有將較長的~160 fs脈沖中的較低THG信號重新縮放后，才有可能獲得高于實驗噪聲底限的圖像，如圖2c所示。在這種情況下，需要提高2.5倍的平均激光功率才能獲得與更短的低于50 fs脈沖獲得的THG信號相當(dāng)?shù)男旁氡萚3]。

圖2:帶有50微米正方形的校準網(wǎng)格(Ibidi)的三次諧波。a) 4.7 mW，全譜短脈沖(<50 fs);VALO系列)。b) 6 mW，激光光譜限制在10 nm帶寬(~160 fs)。c)將6mw激光光譜限制在10 nm帶寬(~160 fs)下的對比度放大。

總之，在多光子顯微鏡中使用極短飛秒脈沖有幾個優(yōu)點，包括減少光損傷，提高效率，提高空間分辨率，減少背景信號。特別是，超短的低于50秒的脈沖提供了相當(dāng)高的脈沖峰值功率，這使的信噪比圖像只需低得多的平均功率，這反過來減少光漂白，并延長細胞活力。這些優(yōu)點使多光子顯微鏡成為研究生物樣品的一種有價值的工具，使研究人員能夠獲得高分辨率。

參考文獻：

[1] Shuo Tang, Tatiana Krasieva, Zhongping Chen, Gabriel Tempea, Bruce Tromberg (2006), Effect of pulse duration on two-photon excited fluorescence and second harmonic generation in nonlinear optical microscopy, Journal of Biomedical Optics, 11(2).

[2] Mira Sibai, Hussein Mehidine, Fanny Poulon, Ali Ibrahim, M. Juchaux, J. Pallud, A. Kudlinski, Darine Haidar (2018), The Impact of Compressed Femtosecond Laser Pulse Durations on Neuronal Tissue Used for Two-Photon Excitation Through an Endoscope, Scientific Reports, 8:11124.

[3] White paper, Sub 50 femtosecond pulse lasers for gentler multiphoton microscopy, HüBNER Photonics. In publication Feb 2023.