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閱讀：53發(fā)布時間：2025-10-4
| 水母毒素的分離純化及蛋白質(zhì)組學(xué)研究 北京締森科技反應(yīng)釜，高壓反應(yīng)器，微型加氫反應(yīng)釜在水母毒素的分離純化及蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用
【作者】 李榮鋒； 【導(dǎo)師】 程； 【作者基本信息】 研究生院（海洋研究所）， 海洋化學(xué)， 2012， 博士 【摘要】 水母(Jellyfish)分布廣、種類多、資源豐富。水母毒素主要分布于觸手的刺絲囊細(xì)胞中，是一類結(jié)構(gòu)新穎且具有多種生物活性的蛋白。但是，由于水母種類的不同，其毒素的結(jié)構(gòu)、生物活性也存在一定的差異。本論文以近年來經(jīng)常在我國近海區(qū)域大規(guī)模出現(xiàn)的霞水母(Cyanea sp.)和沙蜇(Stomolophus meleagris)為研究對象，研究水母毒素的提取制備方法、生物活性、分離純化及其蛋白質(zhì)組學(xué)分析等，主要結(jié)果如下：1.對水母毒素的提取制備方法進(jìn)行了研究。以霞水母為研究對象，首先制備水母的刺絲囊細(xì)胞，然后采用組織研磨器Mini-beadbeater破碎刺絲囊細(xì)胞提取毒素，并且研究了提取過程中蛋白酶抑制劑對霞水母毒素溶血活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1mmol/LEDTA和4μg/mL PepstantinA能夠有效地保護(hù)霞水母毒素的溶血活性。2.研究了水母毒素的溶血活性，并經(jīng)純化得到具有溶血活性的蛋白。霞水母和沙蜇毒素對雞血紅細(xì)胞均具有明顯的溶血活性，其半溶血率HU50分別為10和10.5μg/mL；理化因素對溶血活性的影響中，溫度的影響敏感，在37℃時溶血活性強(qiáng)，但是當(dāng)溫度超過45℃時，其溶血活性明顯降低。采用離子交換層析(DEAE Sepharose Fast Flow)和凝膠過濾層析(Superdex75/200)等分離純化方法，分別從霞水母和沙蜇毒素中分離到具有溶血活性蛋白CnPH和SmTX,其對雞血紅細(xì)胞的半溶血率HU50分別為5和70μg/mL。3.研究了水母毒素的體外抗氧化活性，并對沙蜇毒素的抗氧化活性蛋白進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明，霞水母和沙蜇毒素對羥自由基(·OH）的半清除率EC50分別為200和500μg/mL，對超氧陰離子(O2-·)的半清除率EC50分別約為5.5和75μg/mL。利用硫酸銨分級沉淀和凝膠過濾(Superdex75)兩種分離方法，從沙蜇毒素中分離到分子量為90kDa具有抗氧化活性的蛋白SmP90，該蛋白具有明顯的清除超氧陰離子自由基(O2-·)的能力，其半清除率EC50約為16μg/mL，并且測定其N末端序列為：Asn-Leu-Asp-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Tyr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Gly。4.以沙蜇毒素蛋白為載體，利用Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)方法對水母毒素的蛋白組成進(jìn)行分析，共鑒定出181種蛋白。利用生物信息學(xué)方法將鑒定出來的蛋白質(zhì)進(jìn)行信息學(xué)分析，包括按照生物學(xué)進(jìn)程、細(xì)胞組分及分子功能將其分別分為13、9和7類；并且從生物學(xué)通路里映射到33條相應(yīng)的通路，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了基因網(wǎng)絡(luò)來分析這些蛋白質(zhì)可能存在的酶-酶、蛋白-蛋白以及基因表達(dá)之間的相互關(guān)系。通過本文的研究表明：霞水母和沙蜇毒素具有明顯溶血活性和抗氧化活性，經(jīng)過分離純化，分別從霞水母和沙蜇毒素內(nèi)分離到溶血活性蛋白CnPH和SmTX及抗氧化活性蛋白SmP90；并應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了沙蜇刺絲囊細(xì)胞毒素蛋白，共鑒定出181種蛋白質(zhì)并且利用生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。 北京締森科技反應(yīng)釜，高壓反應(yīng)器，微型加氫反應(yīng)釜
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