一、PCR概述
1、什么是PCR
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。 由美國科學(xué)家PE（Perkin Elmer珀金-埃爾默）公司遺傳部的Dr. Mullis發(fā)明，由于PCR技術(shù)在理論和應(yīng)用上的跨時(shí)代意義，因此Mullis獲得了1993年化學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。
2、PCR技術(shù)發(fā)展史
PCR原理是由一對引物介導(dǎo)，能在動植物體外對特定基因(DNA)片斷進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增，經(jīng)過n個(gè)熱循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0＜E＜1,擴(kuò)增效率＝倍，使得檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)自從1993年到現(xiàn)在很快經(jīng)歷了四代產(chǎn)品：
? ******代：手動/機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)增
如上圖所示，用三個(gè)恒溫水浴箱，分別將三個(gè)水浴溫度恒定在三個(gè)溫度：PCR的高溫變性溫度（如94℃）低溫復(fù)性溫度（如58℃），適溫延伸溫度（如72℃）。再用一個(gè)裝有PCR標(biāo)本試管的提籃，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴，標(biāo)本在每個(gè)水浴箱中恒溫的時(shí)間用秒表計(jì)時(shí)。這樣PCR標(biāo)本就能完成下述形式的熱循環(huán)：
94℃30S 58℃45S 72℃60S 40次循環(huán)
這種方法的特點(diǎn)是：實(shí)驗(yàn)人員勞動強(qiáng)度大，容易因疲勞引起差錯(cuò)；而優(yōu)點(diǎn)是:設(shè)備簡單，投資少，與自動化基因擴(kuò)增儀相比，它無須升降溫過程，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，試驗(yàn)更接近理想PCR反應(yīng)條件，事實(shí)表明實(shí)驗(yàn)效果還是不錯(cuò)的，但由于標(biāo)本試管從一個(gè)水浴箱往另一個(gè)水浴箱移動中要較短暫暴露于空氣中，因此如移動速度不夠快時(shí)也會對標(biāo)本形成溫度干擾，影響結(jié)果。本方法的另外一些缺點(diǎn)包括只能局限三個(gè)溫階（某些PCR反應(yīng)需要多于三個(gè)溫階）、液體污染以及在低氣壓地區(qū)水溫難以燒到94℃變性溫度等。
為改進(jìn)提高本方法的自動化水平，有人設(shè)計(jì)了機(jī)械手裝置，替代上述手工移動標(biāo)本過程，形成了機(jī)械手水浴式基因擴(kuò)增儀，該改進(jìn)解決了實(shí)驗(yàn)人員的高強(qiáng)度勞動問題，但又帶來了一個(gè)機(jī)械手部件大行程頻繁相對運(yùn)動而引起的高故障。這種類型的基因擴(kuò)增儀在九十年代中期我國北京、上海有定型的產(chǎn)品銷售，應(yīng)用也較廣，曾為我國的分子生物學(xué)的發(fā)展做出過積極貢獻(xiàn)，而后便逐步被自動化程度更高的擴(kuò)增儀替代，現(xiàn)在很少有單位使用。
? 第二代：自動化控制型定性基因擴(kuò)增儀
與上述水浴式擴(kuò)增儀相比，也有人稱該種擴(kuò)增儀為干式基因擴(kuò)增儀，它是******代表性的擴(kuò)增儀，包括后續(xù)介紹的第三代、第四代都是以第二代為基礎(chǔ)集成了定量檢測部分。
? 第三代：終點(diǎn)定量/半定量
第二代的定性PCR只能判斷陰性陽性，而無法評價(jià)特定核酸的濃度及定量分析，定量PCR至少能達(dá)到定性PCR無法實(shí)現(xiàn)的下列功能：
?潛伏期病毒濃度探測
?感染程度
?致病病原體數(shù)量變化測定
?抗病物療效評估
?恢復(fù)期病毒載量檢測
自從1996年美國ABI公司發(fā)明******臺熒光定量PCR儀以來，PCR技術(shù)和應(yīng)用從定性向定量快速發(fā)展.終點(diǎn)定量PCR的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備投資少，對于國內(nèi)經(jīng)濟(jì)條件還不能購買昂貴實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的科研單位和醫(yī)療機(jī)構(gòu)，利用現(xiàn)有的第二代常規(guī)定性PCR儀，在添加一臺專用的單孔PCR終點(diǎn)產(chǎn)物熒光定量檢測儀便可開始工作，起到定量的作用。終點(diǎn)定量PCR技術(shù)是從定性向?qū)崟r(shí)定量過渡的一個(gè)中間產(chǎn)品，而PCR終點(diǎn)產(chǎn)物熒光定量儀進(jìn)口產(chǎn)品較少，國產(chǎn)儀器較多，如西安天隆的TL988，上海棱光的DA620型等
第四代：實(shí)時(shí)定量PCR
實(shí)時(shí)定量QPCR儀＋實(shí)時(shí)熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測系統(tǒng)。
2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)勢：
設(shè)備由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實(shí)時(shí)設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實(shí)時(shí)分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實(shí)時(shí)設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正?；幚韥韽浹a(bǔ)背景熒光的差異。正?；罂梢栽O(shè)定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù)）。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為******，這樣可以獲得最準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時(shí)擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計(jì)算未知樣品的濃度。
3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理
所謂real-time Q-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在 real-time 技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。
PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進(jìn)入平臺期。在傳統(tǒng)的PCR 中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物，因此用此終點(diǎn)法對PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real-time Q-PCR中，對整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn) 上來檢測PCR產(chǎn)物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較，在real-time Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號的域值，一般這個(gè)域值（threshold）是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號 （baseline），熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認(rèn)為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的 對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣 品的起始拷貝數(shù)。
4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在醫(yī)療方面的應(yīng)用
⑴ 病原體檢測：目前，采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)。
如：結(jié)核菌基因診斷的意義主要表現(xiàn)在：
a.區(qū)分TB與其它分枝桿菌；
b.檢測TB耐藥基因；
c.提高TB的陽性檢出率。
⑵ 產(chǎn)前診斷：到目前為止，人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產(chǎn)前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種傷性的方法，易為孕婦所接受。
⑶ 藥物療效考核：對乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá)，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。如PCR技術(shù)在HBV檢測中的應(yīng)用及意義：
a.了解乙肝病毒在體內(nèi)存在的數(shù)量。
b.是否復(fù)制。
c.是否傳染，傳染性有多強(qiáng)。
d.是否有必要服藥。
e.肝功能異常改變是否由病毒引起。
f.判斷病人是適合用哪類抗病物。
g.判斷藥物治療的療效。
⑷ 腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機(jī)理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測癌基因的表達(dá)量。目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR技術(shù)將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。
(5)在優(yōu)生優(yōu)育中的應(yīng)用:
近年來經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅猛，人民生活水平逐年提高，對自身及家人特別是下一代的身體健康愈來愈重視。另外，由于國內(nèi)計(jì)劃生育工作逐步走向深化，獨(dú)生子女比較多，孩子的身體素質(zhì)更成為長輩們關(guān)注的焦點(diǎn)。因此，怎樣提高新生兒質(zhì)量改善人類遺傳素質(zhì)，即優(yōu)生優(yōu)育已顯得非常重要。①避免有嚴(yán)重遺傳性疾病和先天性疾病的個(gè)體出生。②增進(jìn)體力、智力優(yōu)秀個(gè)體的繁衍。其中避免有嚴(yán)重遺傳性疾病及先天性疾病個(gè)體出生是優(yōu)生優(yōu)育最基本的內(nèi)容。從臨床優(yōu)生學(xué)角度分析具體工作包括在母親妊娠期間對母親及胎兒進(jìn)行遺傳學(xué)檢查盡量排除常見的遺傳性疾病個(gè)體的出生，另外在妊娠期檢查母親是否患有某些易引起胎兒畸形的傳染性疾病如弓型蟲、風(fēng)疹病毒、衣原體等感染。以往對遺傳性疾病的檢測主要使用染色體分析法，而臨床絕大部分遺傳性疾病是基因病而不是染色體病，染色體發(fā)析法不能檢出的。若使用PCR基因擴(kuò)增法聯(lián)合單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析（sscp）、限制性片段長度多態(tài)性分析（RFCP）等位基因特異性寡核某酸（Aso）點(diǎn)雜交或差異PCR可以很方便地檢出單個(gè)基因的突變而且其準(zhǔn)確性可達(dá)95%以上，因此使這一問題得到了較好的解決。常見的易致胎兒畸形的感染性疾病原體主要有單皰病毒（HSVⅡ）、風(fēng)疹病毒（RV）、人巨細(xì)胞病毒（HCMV）、弓形體（TOX）及沙眼衣原體（CT）。以往這些病原體感染診斷比較困難，主要靠培養(yǎng)法進(jìn)行確診，而培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)，代價(jià)昂貴，而且受到采樣、樣本保存及用藥等因素的影響，基本不能在臨床中推廣。PCR基因擴(kuò)增法因其高敏感性、高特異性非常適合這些疾病診斷及療效跟蹤，是推薦的檢驗(yàn)方法。
PCR基因擴(kuò)增法在遺傳性疾病產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，遺傳病是由于遺傳物變化而引起的機(jī)體某一功能或缺陷或異常所致的疾病，其根本變化在于遺傳物質(zhì)。其類型包括單基因遺傳病，染色體遺傳病及多基因遺傳病。遺傳病診斷除詢問病史，一般物理診斷，普通實(shí)驗(yàn)室檢查及了解癥狀、體征外有特殊性。過去常應(yīng)用系譜分析，染色體及性染色色質(zhì)檢驗(yàn)作為遺傳病診斷的主要依據(jù)，再輔以相關(guān)的酶學(xué)分析從而作出診斷。隨著分子生物不的迅速發(fā)展及其在遺傳性病診斷中的廣泛應(yīng)用，基因診斷技術(shù)誕生，基因診斷技術(shù)為遺傳病的臨床診斷起了很大的促進(jìn)作用。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是基因診斷主要技術(shù)之一。這種快速、靈敏的基因體外擴(kuò)增技術(shù)與多種分子生物學(xué)手段相配合可以檢出大部分已知的基因突變、基因缺失、染色體錯(cuò)位等，PCR技術(shù)日益成為遺傳病診斷的、的方法之一。以下舉幾個(gè)在國內(nèi)有普遍意義的例子。
（一）、尿癥，苯西酮尿證（PKU）是一種常染色體隱性遺傳病，患者因苯丙酸羥化酶轉(zhuǎn)化為酷氨酸，使苯氨酸及其代謝物在體內(nèi)大量蓄積，出現(xiàn)腦組損傷及不可逆性智力發(fā)育障礙。PKU患者出生時(shí)正常，新生兒一經(jīng)確診為PKU停止母乳喂養(yǎng)采用低苯欽食療法8—10年，可使患者智力水平發(fā)展維持正常。由于低苯欽食非常昂貴，一般家庭難以承受，因此，施行產(chǎn)前診斷，防止患兒出生是******的選擇。PAH只在肝細(xì)胞中表達(dá)，不能用血細(xì)胞，成纖維細(xì)胞、羊水、絨毛細(xì)胞進(jìn)行酶活性分析，只能進(jìn)行基因診斷。PKU的基因變化并非全部PAH基因的缺失，而是以點(diǎn)突變?yōu)橹饕憩F(xiàn)形式，而且其突變位點(diǎn)很多。必須使用PCR擴(kuò)增結(jié)合，ASO，SSCP或使用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析（AmpFLA）進(jìn)行檢測，這些技術(shù)都較復(fù)雜，檢驗(yàn)人員須經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)。
（二）、血友病，血友病是一組常見的遺傳性凝血障礙，根據(jù)因子缺陷的不同分為甲、乙兩型，（Ⅷ、Ⅸ因子缺陷），也有復(fù)合型血友病，但不常見。甲型血友病發(fā)病率為1/10000，Ⅷ因子基因位于G6PD基因附近，全長186Kb，大范圍的基因重排（缺失、插入、重復(fù)）導(dǎo)致甲型血友病的病例很少，僅為Ⅷ因子缺陷的5%，大部分病人表現(xiàn)為單個(gè)或少數(shù)堿基的突變。由于Ⅷ因子基因長度為186Kb，突變位點(diǎn)多，而且新生突變頻率高，從臨床角度講不能對每一個(gè)突變都檢測，可對常見的幾種突變類型進(jìn)行檢測，主要的檢測手段是PCR結(jié)合RELP分析。乙型血友病發(fā)病率占血友病的20%，其基因變化及檢測方法與甲型血友病類似。
（三）、PCR檢測地中海貧血；地中海貧血（Thalassemia）是一種遺傳性慢性溶血性貧血病，是常見且發(fā)病北******的一種單基因遺傳病。在兩廣、貴州、四川等地發(fā)病率較高，在廣西等地高達(dá)15%。地中海貧血是由于基因突變造成珠蛋白的不平衡，使結(jié)構(gòu)正常的肽鏈合成量減少甚至沒有合成表現(xiàn)為溶血性貧血。接受累基因種類分為α、β、γ等，其中以 α、β地貧為見，危害了******。珠蛋白基因簇位于人6號染色短臂上，有兩個(gè)重復(fù)基因基因位于α1、α2、兩個(gè)α基因及其旁側(cè)序列有很大的同源性，易出現(xiàn)染色體不等交換，導(dǎo)致α基因缺失－α地貧。α地貧基因部分缺失有α1基因部分缺失、α2基因缺失、α1及α2基因同時(shí)缺失及非缺失型地貧?？梢詰?yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增α1、α2基因從而檢測這些基因是否缺失、突變等，從而對α型地中海貧血作出診斷。β地中海貧血基因缺陷主要表現(xiàn)為基因序列中單一核苷酸的突變，或少數(shù)堿基的缺失、插入，使正常β珠蛋白肽鏈合成減注或缺失。應(yīng)用位點(diǎn)特異性寡核苷探針（Aso）進(jìn)行PCR產(chǎn)物斑點(diǎn)雜交即可對其作出診斷。
（四）、性別發(fā)育異常，區(qū)別雄性及雌性的物質(zhì)基礎(chǔ)是性染色體，哺乳動物胚胎發(fā)育中，雌性表型不需要任何調(diào)節(jié)，而雄性表型則由多因素決定，位于Y染色體上的指導(dǎo)雄性性別分ss化的基因命名為睪丸決定因子（TDF）?，F(xiàn)代研究表明，SRY（Sex-determining region of Y chromosome）基因是TDF基因，位于Y染以體短臂末端。SRY區(qū)缺失易導(dǎo)致46XY核型個(gè)體發(fā)育成女性。進(jìn)行基因檢測可以檢出SRY基因組的易位及缺失，從而診斷性別發(fā)育異常，這一探索性別異常的研究非常熱門。另外還有一種46XY核型異常的病人即睪丸女性化，這是用于雄激素受體（androgen receptor,AR）基因缺欠，使雄激素的靶基因?qū)π奂に夭粦?yīng)答就答或不全而引起的，根據(jù)病情的不同有不同的表型，AR缺陷有很高的新生突變頻率，表現(xiàn)為無家族史的散發(fā)病。AR基因長90Kb，位于X染色體上，AR基因異常大部分為個(gè)別基因堿基的突變，可以通過PCR結(jié)合ASO或SSCP檢出。
（五）、脆—X綜合征，脆—X綜合片（fragile-X Syndrome,Frax）是發(fā)病率******的一種X-連鎖的智力低下綜合征（X-linked mental retardation XLMR）。因這種綜合征與X染色體上的脆位點(diǎn)連鎖而得名。大多數(shù)FRAX男性智商（IQ）低于50，并有隨著年齡增長而下降的趨勢。用人工酵母染色體（artificial yeast chromosome,YAC）克隆技術(shù)分離獲得覆蓋X-脆位點(diǎn)區(qū)域的YAC克隆，在這一克隆中獲得一個(gè)能在人腦中表達(dá)的基因命名為FMR-1（fragile X mentai retardation-1）,FMR-1的5‘端有一個(gè)CGG（精）三核苷酸串（CGG）n,正常人群中（CGG）n中存在多態(tài)性，重復(fù)序列為6-46個(gè)，當(dāng)重復(fù)超過52個(gè)時(shí)，此區(qū)域的分裂呈不穩(wěn)定，導(dǎo)致重復(fù)序列大幅度增加，無臨床表現(xiàn)的攜帶者插入片段長度小于500bg，有臨床表現(xiàn)者，長度都大于600BP而且伴有甲基化。人們將500bp作為前突變與全突變的分界線。對Frax的診斷以前用細(xì)胞遺傳學(xué)的方法檢測脆位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格，成功率不高?，F(xiàn)在采用分子遺傳學(xué)方法即可診出前突變及全突變。用PCR擴(kuò)增CGG重復(fù)序列，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的長度。突變基因的擴(kuò)增片段增大，體細(xì)胞異質(zhì)性時(shí)出現(xiàn)多條長度不等的擴(kuò)增帶甚至拖尾成一片，或者因?yàn)閿U(kuò)充的全突變插入片段過長超出PCR擴(kuò)增能力而結(jié)果無擴(kuò)增現(xiàn)象。
2、PCR基因擴(kuò)增法在“Torsch"診斷中的應(yīng)用，在妊娠早期（1-3個(gè)月），有些病原微生物的感染易導(dǎo)致胎兒畸形，這些病原體中見的有弓體（TOX）、風(fēng)疹病毒（RV）、單純皰疹病毒（HSV）、沙眼衣原體（CT）、及巨細(xì)胞（HCMV），對這幾種病原體的檢測根據(jù)其英文詞首簡稱為Torsch試驗(yàn)。
（一）、弓形體的PCR檢測，弓形體有廣泛的自然疫原性，人體多為隱性感染，抵抗力低時(shí)可以有臨床表現(xiàn)。弓形體的診斷較困難，血清學(xué)方法敏感性較高但有交叉性出現(xiàn)假陽性而且無法確定近期感染、遠(yuǎn)期感染或一過性感染。確診的方法是活組織檢查或動物接各，這些方法陽性率太低不能推廣。PCR檢測可以檢出樣本中1-2個(gè)病原體而且準(zhǔn)確性高，是目前對弓形體檢測******秀的方法。作為優(yōu)生優(yōu)育檢查應(yīng)于妊娠前或妊娠早期取全血樣本，可以用EDTA或肝素抗凝，以EDTA抗凝效果******，檢測外周血白細(xì)胞中是否有TOX存在。對于不孕，多次自然流產(chǎn)或養(yǎng)小動物的產(chǎn)期婦女，作弓形蟲檢測有更重要的臨床意義。
（二）、風(fēng)疹病毒感染：風(fēng)疹病毒（RV）是一種單股正極性RNA病毒，人是風(fēng)診病毒的******宿主。RV感染可以引起胎兒的畸形，影響胎兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育，因此RV檢測在優(yōu)生優(yōu)育工作中顯得非常重要。RV檢測可以用直接培養(yǎng)法及IgM抗體測試法。培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)很長而且常受到其它病毒的干擾，IgM測定法結(jié)果了不太準(zhǔn)確，PCR法敏感性及特異性都很高而且簡便快速，是RV感染******秀的測試方法之一。風(fēng)疹病毒侵入體內(nèi)后在上呼吸道增殖而出現(xiàn)癥狀，面部出現(xiàn)丘疹，迅速遍及全身。樣本采用妊娠母親的咽部拭子、血清、產(chǎn)婦的絨毛或妊娠如羊水等。RV病毒是RNA病毒，PCR擴(kuò)增較復(fù)雜，應(yīng)注意樣本的采集時(shí)機(jī)，操作的準(zhǔn)確性。
（三）、單純皰診病毒，單純皰疹病毒（herpes simplex virus,HSV）是一種DNA病毒，可引起多器官的炎癥，可通過性接觸傳播。HSVⅡ感染復(fù)發(fā)率高，80%的感染者于12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)。HSV感染后經(jīng)機(jī)體免疫系統(tǒng)清除，少數(shù)病人終生攜帶，體弱時(shí)復(fù)發(fā)。PCR法檢測HSV敏感性高而且可以直接對HSVⅠ/Ⅱ型進(jìn)行分型鑒定。
（四）、沙眼衣原體，沙眼衣原體（CT）不僅能引起沙眼而且能引起生死器感染，是一種性傳播性疾病。與淋病（NG），梅毒等經(jīng)典性傳播性疾病不同，CT易經(jīng)其它接觸途徑傳播，少數(shù)地區(qū)對妊娠期婦女普查結(jié)果表明此人群中發(fā)病率高達(dá)20%-30%。在歐美等國家CT的感染已超過淋病而居性傳播性疾病。衣原體感染常呈無癥性或非特異性癥狀的隱性感染，不容易診斷。以往用培養(yǎng)法進(jìn)行確診，費(fèi)時(shí)且敏感性、準(zhǔn)確性都不足。PCR用于CT檢測時(shí)應(yīng)注意不同檢測目的的取材不同，對于性傳播性疾病診斷應(yīng)取生殖道分泌物（查脫落細(xì)胞），而對于早期妊娠病人應(yīng)查其全血樣本，在妊娠后期或臨產(chǎn)時(shí)再查陰道分泌物以便指導(dǎo)生育時(shí)產(chǎn)道清理。
（五）、人巨細(xì)胞（HCMV），HCMV感染十分普遍，除少數(shù)原發(fā)性感染發(fā)生原發(fā)性單核細(xì)胞增多癥外，極大多數(shù)為隱性感染。HCMV可以長期潛伏在體內(nèi)，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，病毒會激活而造成嚴(yán)重疾病在妊娠期如果孕婦感染HCMV可以引起早產(chǎn)、畸形、死胎及新生兒巨細(xì)胞包涵體病等。HCMV屬皰疹病毒科，可以從唾液、尿、宮頸分泌物及乳汁排出。HCMV“金標(biāo)準(zhǔn)"的診斷試驗(yàn)是用單層成纖維細(xì)胞作病毒培養(yǎng)，其它的實(shí)驗(yàn)檢查有血清學(xué)的檢測及包涵體檢測。
PCR是HCMV檢測的一種新方法，用于檢測的樣本有血，生殖道分泌物拭子等，用于優(yōu)生優(yōu)育檢測時(shí)應(yīng)取血樣本。對于早期妊娠病人若有HCMV感染應(yīng)再檢測羊水，或其它妊娠物，對病人認(rèn)真及進(jìn)跟蹤檢查，綜合判斷并采取相應(yīng)的醫(yī)療措施。
PCR應(yīng)用于優(yōu)生優(yōu)育有很大的性，使這一技術(shù)的推廣應(yīng)用剛剛起步，應(yīng)注意操作的準(zhǔn)確性，盡量避免誤診。對感染性疾病首先應(yīng)取孕婦血樣檢測，有可疑時(shí)或血中檢出病原體核酸時(shí)應(yīng)盡早作羊水等妊娠物檢查。不管是否懷疑胎兒有嚴(yán)重遺傳病傾和中或有感染引起的畸形風(fēng)險(xiǎn)，對胎兒的去留應(yīng)尊重胎兒父母親的意見。
5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在研究方面的部分應(yīng)用
1） 新藥開發(fā)研究，人用藥物及其他藥物
針對一些感染性疾病的藥物，如各種病毒病、細(xì)菌病等，在新藥的開發(fā)過程中，快速了解藥物對疾病進(jìn)程的影響可以為新藥開發(fā)節(jié)約大量的人力、時(shí)間和資金，與以前所用的Elisa等方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確、定量、靈敏地測定血液或組織中病原體的含量，因此有利用分析藥物的作用效果，為比較不同的配方的療效、用藥量、用藥時(shí)間等等提供快速、定量的評價(jià)。
此方法除了用于人用藥物以外，還可以用于畜用藥物，甚至其他經(jīng)濟(jì)動物及植物的藥物研究等，因此其在藥物研究方面的應(yīng)用范圍是很廣的。
2） 超早期感染用藥物及療法的研究與開發(fā)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人體內(nèi)產(chǎn)生抗體，同時(shí)，由于其靈敏度與Elisa相比不可同日而語，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低時(shí)就可以測定。因此就出現(xiàn)了一個(gè)新的領(lǐng)域，即在病毒或細(xì)菌含量很低時(shí)如何用藥，用什么藥以及用藥量等進(jìn)行研究，為將疾病消滅在超早期作出貢獻(xiàn)。
3）藥物療效研究，人用藥物及其他藥物
對于一些已經(jīng)上市的新藥或是應(yīng)用了很長時(shí)間的老藥，其用藥的效果以及用藥量及用藥時(shí)間都可以進(jìn)行進(jìn)一步的研究，為更加合理化的應(yīng)用這些藥物為人類造福進(jìn)行進(jìn)一步的研究。以前所用的方法由于不能準(zhǔn)確定量，靈敏度也不夠，因此有很多需要研究的內(nèi)容沒有完成。這一方面需要研究內(nèi)容很多，意義也很大。
4）新的愈后指標(biāo)的研究
對于感染性疾病，在藥物作用至一定程度后，就認(rèn)為可以停藥了，但是應(yīng)該在什么停藥，現(xiàn)在大都沒有一個(gè)明確的指標(biāo)，現(xiàn)在所用的指標(biāo)由于受到檢測方法的靈敏度及準(zhǔn)確性限制，這一指標(biāo)未必合理，因此有必要對的指標(biāo)以及指標(biāo)與復(fù)發(fā)率以及疾病轉(zhuǎn)化為其他疾病之間的關(guān)系等進(jìn)行進(jìn)一步的研究，從而為藥物或療法疾病打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
5）新診斷及檢驗(yàn)試劑的開發(fā)
現(xiàn)有的很多診斷及檢驗(yàn)方法都不能同時(shí)滿足快速、靈敏、定量的要求如現(xiàn)有培養(yǎng)法、Elisa法等等，而熒光定量PCR方法以則可以做到這一點(diǎn)，從而可為臨床疾病、商檢、糧油檢驗(yàn)、食品檢驗(yàn)、血液檢驗(yàn)等等開發(fā)新的試劑，從而提高檢驗(yàn)的靈敏度、速度及準(zhǔn)確性等；這類試劑的種類是非常多的，所開發(fā)的試劑的社會效益及經(jīng)濟(jì)效益都是很巨大的。
6）血液檢驗(yàn)漏檢率
由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比Elisa靈敏很多，因此，血站或血液研究所一般用來研究Elisa方法的漏檢率，即分析Elisa方法測定為陰性的血樣，再用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法來復(fù)檢。復(fù)檢時(shí)，一般24個(gè)Elisa陰性的血樣混合成一個(gè)樣本進(jìn)行檢測。上海用此方法在用于血液制品的血液中發(fā)現(xiàn)一例HIV，后經(jīng)測定供血者，證實(shí)病人的確是HIV陽性。北京市紅十字血液中心正在測定北京血站中5萬份Elisa陰性血樣的漏檢率。由于不同地區(qū)所用的Elisa試劑、方法、批號等都不相同，因此不同地區(qū)都有必要進(jìn)行這一工作。
由于熒光定量PCR方法的快速、靈敏、定量的特點(diǎn)，其在研究及開發(fā)方面的應(yīng)用是不勝枚舉的，如研究個(gè)人基因型與藥物療效之間的關(guān)系等；研究人員也可以根據(jù)自己研究項(xiàng)目開發(fā)其新的用途。
二、TL988實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)產(chǎn)品介紹
1、如何選擇一款適合自己的PCR儀
回顧分子生物學(xué)的發(fā)展歷程，PCR技術(shù)的發(fā)明和普及無疑是最重要的篇章之一。而PCR技術(shù)在近20年的不斷發(fā)展創(chuàng)新中，矚目當(dāng)屬熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量PCR技術(shù)真正實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，通過對PCR過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控，專一、靈敏快速、可重復(fù)地精確定量起始模版濃度，已經(jīng)在科研和臨床診斷領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。我公司從熒光定量PCR的原理入手，詳細(xì)介紹熒光定量PCR儀的類型和技術(shù)，為定量PCR儀的選擇提供詳細(xì)參考。
定量PCR儀主要由兩部分組成，一個(gè)是PCR系統(tǒng)，一個(gè)是熒光檢測系統(tǒng)。從前面的原理介紹不難看出選擇定量PCR儀的關(guān)鍵--由于定量PCR必需借助樣本和標(biāo)準(zhǔn)品之間的對比來實(shí)現(xiàn)定量的，對于定量PCR系統(tǒng)來說，重要的參數(shù)除了傳統(tǒng)PCR的溫控精確性、升降溫速度等等，更重要的還在于樣品孔之間的均一性，以避免微小的差別被指數(shù)級放大。至于熒光檢測系統(tǒng)，多色多通道檢測是當(dāng)今的主流趨勢--儀器的激發(fā)通道越多，儀器適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬；多通道指可同時(shí)檢測一個(gè)樣品中的多種熒光，儀器就可以同時(shí)檢測單管內(nèi)多模版或者內(nèi)標(biāo)+樣品，通道越多，儀器適用范圍越寬、性能就更。熒光檢測系統(tǒng)主要包括激發(fā)光源和檢測器。激發(fā)光源有鹵鎢燈光源、氬離子激光器、發(fā)光二極管LED光源，前者可配多色濾光鏡實(shí)現(xiàn)不同激發(fā)波長，而單色發(fā)光二極管LED價(jià)格低、能耗少、壽命長，不過因?yàn)槭菃紊?，需要不同的LED才能更好地實(shí)現(xiàn)不同激發(fā)波長。監(jiān)測系統(tǒng)有超低溫CCD成像系統(tǒng)和PMT光電倍增管，前者可以一次對多點(diǎn)成像，后者靈敏度高但一次只能掃描一個(gè)樣品，需要通過逐個(gè)掃描實(shí)現(xiàn)多樣品檢測，對于大量樣品來說需要較長的時(shí)間。定量PCR儀需要考慮的另外一個(gè)因素是軟件設(shè)計(jì)，這一點(diǎn)目前較新型號的儀器都有不錯(cuò)的配套軟件可以滿足常規(guī)使用。--隨著定量PCR技術(shù)在臨床診斷、疾病?
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