三棱為黑三棱科植物黑三棱 Sparganium stoloniferum Buch.-Ham.的干燥塊莖，主要分布于 我國東北、黃河、長江中下游流域，野生資源較 為豐富。三棱味辛、苦，性平，入肝、脾經(jīng)，具 有破血行氣、消積止痛等功能，用于癥瘕痞塊， 瘀血經(jīng)閉，食積脹痛，主要含有黃酮和黃酮苷、 苯丙素苷、甾體及其苷、有機酸等化合物。阿魏 酸具有抗血小板聚集、抗血栓等作用，這與三棱 活血化瘀的傳統(tǒng)功效相符，可能為破血活性成分； 黃酮類成分具有較強的抗血小板聚集、抗血栓和 鎮(zhèn)痛作用。本研究通過建立三棱藥材入血成分 對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和蘆丁的含量測定方法，考察三棱藥材血中移行成分。
1 材料
1.1 藥材三棱藥材購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠， 經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學藥學院宋捷民教授鑒定為浙江 產(chǎn)三棱，符合中國藥典 2015 年版一部相關規(guī)定。
1.2 動物SPF 級 SD 大鼠，10 只，♂，體質(zhì)量 180~200 g， 由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可 證號：SCXK(滬)2014-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度 25~27 ℃，濕度 40%~60%，適度照明，食物充足， 自由飲水。
1.3 儀器及試劑Agilent 1200 型高效液相色譜儀器 ( 美 國 Agilent) ； Agilent Eclipse XDB-C18 色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；XS205DU 型精密天平 (Mettler Toledo 公司)；2-16PK 型離心機(德國 Sigma 公司)；QL-861 型渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造)；SK5210HP 型超聲波清洗儀(上海科 導超聲儀器有限公司)；ND100-1 型氮氣吹掃儀(杭 州瑞誠儀器有限公司)。 乙腈(色譜純，批號：AS1122-801)、甲醇(色 譜純，批號：MS1922-801)購自 Tedia 公司；磷酸(成 都科龍化工試劑廠，分析純，批號：7664-38-2)； 水為超純水。對羥基苯甲酸對照品 ( 批號： MKBK3576V；純度≥99%)、香草酸對照品(批號： 110776-20150；純度：98%)、阿魏酸對照品(批號： 110773-20161；純度≥98%)、蘆丁對照品(批號： Y23M7N11586；純度≥98%)、內(nèi)標物核黃素(批號： JS0925RA14；純度≥99%)均購自中國食品藥品檢 定研究院。
2 方法
2.1 三棱水煎液制備方法傳統(tǒng)煎煮法：三棱藥材 100 g，加去離子水 800 mL 浸泡 0.5 h 后進行煎煮，煮沸 0.5 h，4 層濾 布濾出藥液，再次加水 500 mL 煮沸 0.5 h，濾過， 2 次藥液合并，濃縮至 50 mL，制成含生藥 2 g·mL?1 的三棱水煎液原液，110 ℃高壓滅菌 30 min，冰 箱冷凍保存。
2.2 含藥血清制備取 180~200 g 的 SD 大鼠 10 只，飼養(yǎng) 1 周。 按照生藥濃度 2 g·mL?1 ，劑量 0.2 mL·kg?1 ，計算 大鼠的常規(guī)給藥劑量；每天灌胃 1 次，連續(xù)灌胃 7 d。末次給藥前禁食 12 h，第 7 天末次給藥后， 于 1，2，4 h 分別從同一只大鼠眼眶靜脈叢取血， 收集大鼠血液至離心管中，3 000 r·min?1 離心 10 min，收集上層血清，56 ℃滅活 30 min，取出 后無菌過濾，后放入?20 ℃冰箱保存，為含藥血清。
2.3 對照品及內(nèi)標的配制精密稱取對羥基苯甲酸對照品、香草酸對照 品、阿魏酸對照品、蘆丁對照品適量，用甲醇水 溶液(1∶1)溶解，配制對照品濃度為 1 mg·mL?1 的 混合對照品儲備液，渦旋儀充分混勻，超聲30 min， 0.22 μm 微孔濾膜過濾，4 ℃保存，檢測前稀釋成 不同濃度。精密稱取內(nèi)標物核黃素適量，用甲醇水溶液 (1∶1)溶解，配制內(nèi)標物濃度為 1 mg·mL?1 的儲備 液，渦旋儀充分混勻，超聲 30 min，0.22 μm 微孔 濾膜過濾，4 ℃保存。
3 結果與分析按“2.4”項下方法處理大鼠空白血清，按“2.5” 項下色譜條件進行測定，空白血清的 內(nèi)源性物質(zhì)與對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和 蘆丁對照品及內(nèi)標物的分離度良好，且沒有干擾 物質(zhì)，內(nèi)源性物質(zhì)與各藥品及代謝物之間不存在 相互作用，說明方法的專屬性良好。血清中對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和蘆丁的 回歸方程分別為 Y=56 971.00X+282.99(r 2 =0.999 8)， Y=36 756.00X+247.66(r 2 =0.999 7)，Y=50 686.00X+ 89.41(r 2 =0.999 8)，Y=36 349.00X+20.99 (r 2 =0.999 7)， 各成分均在質(zhì)量濃度 0.000 5~0.25 mg·mL?1 內(nèi)線 性關系良好。按信噪比(S/N)為 3 來計算，對羥基 苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁的檢測限均 為 0.000 1 mg·mL?1 。計算得到各組含藥血清樣本的精密度 RSD<10%，方法回收率>90%，基質(zhì)效應考察結果 為 89.45%~95.12%；各組樣品穩(wěn)定性均 RSD<10%， 表明本實驗精密度良好，回收率和穩(wěn)定性均符合 藥動學要求。利用所建立的方法，對灌胃給予中藥三棱后 所采取的 10 只大鼠血清樣品進行含量測定，說明該方法能夠簡單、準確測定大鼠血漿 中三棱的 4 種有效成分的血藥濃度。
4 討論本研究采用 HPLC 梯度洗脫同時準確、快速 測定三棱藥材入血成分對羥基苯甲酸、香草酸、 阿魏酸和蘆丁的含量，分離效果好。色譜條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，水相加入適量的磷酸可以改善峰形并能 提高分離度，當酸度為 0.1%時待測成分均可分離， 效果較好。本研究為進一步研究三棱藥材活性成 分與藥效物質(zhì)基礎提供一定的實驗參考。
免責聲明：文章僅供學習和交流，如涉及作品版權問題需要我方刪除，請聯(lián)系我們，我們會在時間進行處理。
