上海蟻霖科學儀器有限公司
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閱讀：138發(fā)布時間：2021-11-8
人胳帶間充質(zhì)干 細胞（ ｕｍｂ ｉ ｌｉ ｃａｌ ｃｏ ｒｄ ｍｅｓｅ ｎｃ ｈ？ｙｍａｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅｌ ｌ ｓ ， Ｕ Ｃ ＭＳＣｓ ） 數(shù)量豐 富 ， 在組織 工程 和細胞 治療領(lǐng) 域具有很大 的應用 價值 。 近年來 ， 研究發(fā)現(xiàn)人 ＵＣＭ ＳＣ ｓ 具有 免疫調(diào)節(jié) 和 分化為 肝細 胞的 能力 ， 在治療肝臟疾病方面有 顯著 的 療效。
１ 材料與方法
１ ． １ 動物 、 試劑 、 藥物與儀器
４０ 只 健康 Ｓ Ｄ 大 鼠 ，體 質(zhì)量為 （１ １ ０ ± ２ ０ ） ｇ ， 雌雄 各半 ， 購 自 北京維通 利華 實 驗 技 術(shù) 有 限 公 司 【 許 可 證 號 Ｓ ＣＸＫ （ 京 ）２ ０ １ １－００ １ １ 】 。 ＩＩ 型膠原酶（ Ｓｉ ｇｍａ ， 美 國 ） ； Ｄ － Ｈａ ｎｋ’ｓ液 、 胎 牛 血清 、 ＤＭＥ Ｍ／Ｆ １ ２ 培養(yǎng)基 、 ０ ． ２５ ％胰蛋 白 酶 、Ｍｅｓ ｅ ｎ ＰＲＯ Ｒ ＳＴＭＭｅ ｄｉ ｕｍ （ Ｇｉ ｂｉ ｃ ｏ ， 美 國 ） ； 市 售 ５ ６ ？紅星二鍋頭 ； 檢測血清丙氨 酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ ＡＬＴ ） 、天門 冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ ＡＳＴ ） 、 丙二酸（ ＭＤＡ ） 、 超氧化物歧化酶 （ ＳＯ Ｄ ） 、 谷胱 甘肽過 氧化物酶 （ ＧＰｘ ） 試劑盒（ 南京建成 生物 工程研究所 ） ； 蘇木精 －伊紅染色液（ 北京索萊寶） ； Ｔｒａｎｓ Ｓｃ ｒ ｉｐ ｔ Ｏｎ ｅ－Ｓｔ ｅｐ ｃ Ｄ ＮＡ 合成試劑盒和 Ｔａｐ ＰＣ Ｒ Ｍｉｘ （ 北 京全式金生 物技術(shù)有限公司 ） ； ＣＹＰ２Ｂ １ 引 物設計及合成 （ 金斯瑞生物科技公司 ） 。 ＧＬ 為本實驗室 自 制 ｄ 光學顯微鏡（ Ｏｌ ｙｍｐｕｓ ，日 本 ） ； 低溫 高 速離心 機（ Ｔｈｅｒｍｏ ， 美 國 ） ； ＰＣ Ｒ 分析儀 （ ＡＢ Ｉ， 美 國 ） ；酶標儀 （ Ｂ ｉ ｏ Ｔ ｅｋ ， 美 國 ） ； 恒 溫震蕩儀（ 其林貝爾儀器設備有 限公司 ） ； ６ 孔板 、 培養(yǎng)瓶 、培養(yǎng)皿（ Ｃｏ ｍｉｎ ｇ ， 美 國 ） 。
１ ． ２ Ｕ Ｃ ＭＳＣ ｓ 培養(yǎng)
經(jīng)醫(yī)院 醫(yī)學倫理委員會批準。 經(jīng)過產(chǎn)婦知 情同 意后 ， 采集正常 足 月 剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶組織 ，置人 Ｈａ ｎｋ’ｓ 液 ， ４ 尤保存 。 在超凈 臺 內(nèi) 取 出 胳帶 ， 用 ＰＢ Ｓ 沖洗血液 ， 用 剔除胳 帶 內(nèi)血管 ， 將成 １ ￣ ２ ＿３組織塊 ， 放人培養(yǎng)瓶 ， 加人 Ｉ Ｉ 型 膠原酶消 化 ， 過濾 、 收集 細胞 ，接種在 ６ 孔板內(nèi) ， 置于 Ｃ ０２ 培養(yǎng)箱 內(nèi) 培 養(yǎng)。 ９６ ｈ 后半量更 換培養(yǎng)液 ， 以 后 隔 半天半量換 液 ， 顯微鏡 下觀察 ， 大約 １ ０ ｄ 后 ， 細 胞融合達到 ８ ０ ％時 ， 進行 傳代培 養(yǎng)。
１ ． ３ 慢性 ＡＬＤ 動 物模型 的 建 立與 細胞移植
干預 ｎ取 ４ ０ 只 ＳＤ 大 鼠 ， 正常詞養(yǎng) １ ｗ ， 給予其 中 ３０ 只 白酒 １ ０ ｍｌ’ ｋｇ－１ 灌 胃 ，早 晚各一次 ， 連續(xù) ３ ０ ｄ 。 待大鼠狀態(tài) 變差 ， 活 動減少 ，精神 萎靡 ， 毛 發(fā)無光 澤時 ，即 建立慢性 ＡＬＤ 模型成功 。 將 ＡＬＤ 動物 隨機分 為模型 組 （ Ｂ 組 ） 、 臍帶 間 充質(zhì)干 細胞移 植組（ Ｃ 組 ） 和臍帶間 充質(zhì)干細胞聯(lián)合甘草酸處理組（ Ｄ 組 ） 。 給予Ｂ 組動物生 理鹽水 〗 ｍｌ ， 給予 Ｃ 組 動物 Ｕ ＣＭＳ Ｃｓ（ １ ｘ ｌ Ｏ Ｄｌ ｍｌ ， 給 予 Ｄ 組 動 物 ＵＣ ＭＳＣ ｓ （ ｌ ｘ１ ０Ｗ／Ｌ ） 和 甘草酸（ １ ００ ｍｇ‘ｋｇ＿ｌ） ｌ ｍｌ ， 門靜脈注射 ， 另１ ０ 只 為對照 組（ Ａ 組 ） ， 給予生理鹽水 １ ｍ ｌ 門 靜脈注射。１ ． ４ 血清檢測 在細 胞移植 ２ ｗ 后 ， 經(jīng)尾靜脈取血 ，４Ｘ； 、 ４ ０００ ｒ／ｍ 離心 １ ０ ｍｉ ｎ ， 分離 血清 ， 于 － ２０ Ｔ：冰箱保存 ， 備測。
１ ． ５ 肝組織病理學檢查
取血后 ， 即 刻取出 肝臟 ， 取部分肝組織用 １ ０ ％甲 醛 固定 ， 常規(guī)石蠟包埋 切片 ，ＨＥ 染色 ， 光學顯微鏡下觀察 。
１ ． ６ 肝組織細
胞色素 Ｐ４５ ０ 亞 酶 （ ＣＹ Ｐ２ Ｂ １） ｍＲＮＡ水 平檢測 采用 ＲＴ－ＰＣＲ 法 ， 在液 氮 中 研磨 肝組織 ， 加 人 Ｔｒｉ ｚｄ 溶液提取 總 ＲＮ Ａ 。 應用核酸蛋 白 儀和瓊脂糖 電泳對提取 的 ＲＮＡ 進行分析。 取 總 ＲＮＡ４ ｝＾， ８ ２ １ 水浴 ５ 以１１ ， 加 人反轉(zhuǎn)錄 反應液 ， ４４￡￡ 孵育 ６０ ｍｉ ｎ ， 留 取產(chǎn)物待用 。擴增參數(shù) ，９ ５ １ １ ０ ｍｉ ｎ ， ６ ０ Ｔ； ５ ０ ｓ ， ７２ Ｔ：延伸 ５０ ｓ ， ７ ２ Ｔ： 延 伸１ ０ ｍ ｉ ｎ Ｊ Ｏ Ｔ 保存 。 基 因 水平分析采 用 ２－ｍ 法 ， 將ＧＡＰＤＨ 設 為 內(nèi) 參 ， 取 Ｃ ｔ 值 。 計算公式為 ： Ａ Ｃｔ＝ Ｃｔ（ 目 的基 因 ）－Ｃｔ （ ＧＡ ＰＤＨ ） ； Ａ Ａ Ｃｔ ＝ Ａ Ｃｔ （ 實 驗組 ）－么 ０ （ 對照組 ） 。
２ 結(jié)果
２ ． １ 肝組織病
理學變化 Ａ 組 大 鼠 肝組織結(jié) 構(gòu)完整 ， 肝 小葉結(jié) 構(gòu) 清晰 ， 細胞形態(tài)規(guī)則 ， 細胞 核 圓 形 ，胞 質(zhì)豐滿 ， 無異常改 變（ 圖 １ Ａ ） ；Ｂ 組 大鼠肝小 葉 界限 不清 晰 ， 肝細 胞索排列紊亂 ， 細 胞核模糊 不清 ， 肝細胞胞質(zhì) 內(nèi) 有大小不等的 圓 形脂骯空泡 ， 部分肝細胞 腫脹，可 見點 灶壞死 和 部分炎性 細 胞 浸潤 （ 圖１ Ｂ ）； Ｃ 組和 Ｄ 組肝損 傷有不同 程 度 的 減輕 ， 以 Ｄ 組減輕較明 顯（ 圖 １ Ｃ 、 圖 １ Ｄ ） 。
２． ２ ＵＣＭＳ Ｃｓ 形態(tài)學觀察結(jié)果
體 外培 養(yǎng)細 胞 ３ ￣ ５ｈ ， 細 胞開始貼壁 ， ４ ８ ｈ 完 全貼壁 ， 出 現(xiàn) 長梭形 和少量成纖維樣細 胞。 隨著 傳代次數(shù) 的增加 ， 成纖維樣的Ｕ Ｃ Ｍ ＳＣ ｓ 增殖 速度加 快 ， 擴 增純化后 的 第 ３ 代臍帶間 充質(zhì)干 細胞形態(tài)似長梭形 ， 呈輻射狀生長（ 圖 ２ ） 。
２ ． ３ 各組大 鼠 血清指標水平
比 較 與 Ａ 組 比 ， Ｂ 組大鼠 血清 Ａ ＳＴ 、 ＡＬＴ 和 Ｍ Ｄ Ａ 水平顯 著升高 ，而 Ｓ Ｏ Ｄ和 ＧＰｘ 水 平顯著降低 ； 與 Ｂ 組 比 ， Ｃ 組和 Ｄ 組血清ＡＳＴ 、 Ａ ＬＴ 和 Ｍ ＤＡ 水 平顯著下降 （ ｆ ＜ ０． ０５ ） ， ＳＯ Ｄ 和ＧＰｘ 水平顯著 升高 。
３ 討論
研究指 出 ，酒精 中 的 乙 醇在代謝時產(chǎn)生大量 的自 由 基 ， 致使肝細 胞膜 發(fā)生 脂質(zhì)過 氧化 ， 能引 起 肝臟組織 中 的肝細 胞損 傷和 死亡 ， 導致轉(zhuǎn)氨酶升高 。酒精 代謝過程 中 產(chǎn)生 的 乙 醛會對肝細胞產(chǎn)生 毒性作用 ， 抑制 谷胱； 甘 肽（ ｇｌ ｕ ｔ ａｔ ｈ ｉ ｏ ｎｅ ， ＧＳＨ ） 的合成 ， 減弱ＳＯ Ｄ 等抗 氧化能力 ，導致大量 ＭＤ Ａ 等 氧化物 的 生成ｉ８＼ Ｍ Ｄ Ａ 的含量可 以 反映 出 機體細胞 受 自 由 基攻擊 的 程 度 ， Ｓ Ｏ Ｄ 、 ＧＳ Ｈ 的 活 性 高 低是 反 映 機體抗 氧化能 力 的指標Ｍ。 Ａ ＴＬ 和 Ａ ＳＴ 存 在 于 肝細胞漿 中 ，當 肝細 胞受損 時 ， 可使血 清 Ａ ＴＬ 和 Ａ ＳＴ 水平升 高 ，是肝損 傷 的敏感指標 。
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