上海蟻霖科學儀器有限公司
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閱讀：204發(fā)布時間：2021-11-8
糖尿?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病致死率的微血管并發(fā)癥，也是導致終末期的主要原因。DN 的主要病理特征為腎小球基底膜增厚、細胞外基質(zhì)和系膜擴張、腎小球硬化伴有不同程度的腎間質(zhì)和腎小管損害。DN 的發(fā)病機制包括腎素-血管緊張素-醛固酮（RAAS）激活導致的血流動力學異常和血流變因素、糖代謝紊亂、糖基化終產(chǎn)物、各種生長因子及細胞因子、氧化應(yīng)激反應(yīng)、遺傳因素等。其中，高血糖導致的氧化應(yīng)激起了關(guān)鍵作用。有研究表明，核因子紅細胞衍生 2 相關(guān)因子/血紅素氧合酶（Nrf2/HO-1）是細胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激最重要的通路之一。
1 材料
1.1 實驗動物
自發(fā)型 2 型糖尿病 C57BLKS/Jdb/db 小鼠（db/db）10 只，雄性，9 周齡，體質(zhì)量（35.10±1.41）g（33～37 g），同遺傳背景的 C57BLKS/Jdb/+小鼠（db/m）10 只，雄性，9 周齡，體質(zhì)量（19.84±1.18）g（18～22 g），購自南京大學模式動物研究所，許可證號 SCXK（蘇）2018-0008。本研究已通過南開大學動物護理與使用委員會批準。
1.2 藥物與試劑
五味子（天津市中藥飲片廠有限公司，批號1806038-01），經(jīng)天津市醫(yī)藥科學研究所賈淑杰主任技師鑒定為木蘭科植物五味子 Schisandra chinensis(Turcz.) Baill. 的干燥成熟果實；小鼠尿微量白蛋白ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（北京碧云天生物科技有限公司）；過碘酸雪夫（PAS）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；PCR 引物（北京六合華大基因科技有限公司）；兔抗 Nrf2 多克隆抗體、兔抗 HO-1 多克隆抗體、兔抗 β-actin 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG 二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；自行配制 TBST 緩沖液、5%牛奶封閉液、1×RIPA 蛋白裂解液、5×SDS、1×Running、1×Transfer。
1.3 主要儀器
、*（羅氏血糖健康醫(yī)護公司）；臺式高速低溫離心機、酶標儀（美國 Thermo FisherScientific 公司）；SCIENTZ-48 高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；超微量分光光度計（上海析譜儀器有限公司）；PCR 儀、瓊脂糖凝膠電泳及成像系統(tǒng)、SDS-PAGE 電泳儀與轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國 Bio-Rad 公司）；電熱恒溫金屬?。ê贾輮W盛儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（天津化工有限公司）；脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；石蠟切片機（德國 Leica 公司）；CX31 正置顯微鏡（日本 Olympus 公司）。
2 方法
2.1 動物分組
10 只 C57BLKS/Jdb/db 小鼠和 10 只 db/m 小鼠在溫度（22±2）℃，相對濕度（60±10）%，保持12 h 光照/12 h 黑暗交替的動物房中進行飼養(yǎng)，并保證相同自由飲水和常規(guī)飼料喂養(yǎng)，每 2 天更換 1 次墊料。順應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，稱體質(zhì)量并測血糖，C57BLKS/Jdb/+小鼠隨機分為對照組和 SE 對照組，C57BLKS/Jdb/db 小鼠隨機分為模型組和 SE 治療組，每組 5 只。
2.2 藥物制備
按照 Zhang 等的方法和步驟，用乙醇循環(huán)萃取法制備 SE，五味子 100 g 用 95%乙醇每次加熱回流 3 h，共提取 2 次，合并 2 次提取液，靜置濾過，減壓回收乙醇濃縮成浸膏，4 ℃保存，實驗時稀釋最終得到含生藥 1 mg/mL 的 SE（經(jīng)高效液相色譜分析，SE 中五味子甲素和五味子乙素的質(zhì)量分數(shù)分別為 1.38%和 1.46%）。
2.3 給藥方法
小鼠 10 周齡時開始 ig 給藥，SE 對照組與 SE治療組給予5 mg/kg的SE（給藥前將SE放至室溫，混勻后備用），對照組與模型組 ig 等量雙蒸水，每天 1 次，連續(xù)給藥 6 周。
3 結(jié)果
3.1 各組小鼠體質(zhì)量、血糖、24 h 尿微量白蛋白測
定結(jié)果結(jié)果如圖 1 所示，在實驗 0 周時，與對照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量、血糖和 24 h 尿微量白蛋白均顯著增高（P＜0.01）；SE 對照組與對照組比較，體質(zhì)量、血糖和24 h尿微量白蛋白水平差異不顯著；在 3、6 周時，SE 治療組的血糖和 24 h 尿微量白蛋白水平明顯低于模型組（P＜0.05、0.01），但 SE 治療組與模型組比較，小鼠體質(zhì)量無明顯變化；對照組與 SE 對照組小鼠體質(zhì)量亦無明顯差異。
3.2 氧化應(yīng)激指標
結(jié)果如圖 2 所示，與對照組相比，模型組的MDA 顯著升高（P＜0.01）；SE 對照組 MDA 水平與對照組比較差異不顯著；與模型組相比，SE 治療組的 MDA 水平顯著降低（P＜0.01）。
4 討論
DN 是在糖尿病病程中出現(xiàn)的以蛋白尿、高血壓、水腫、腎功能不全等腎臟病變?yōu)樘卣鞯募膊?，其早期臨床表現(xiàn)為腎小球高濾過率，尿微量白蛋白排泄率正常，隨著病情進展，出現(xiàn)微量白蛋白尿、甚至大量蛋白尿、腎小球濾過率下降，最終導致腎功能不可逆損害，形成終末期。
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