北京心動康達(dá)信息技術(shù)有限公司
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閱讀：2015發(fā)布時間：2022-9-16
心臟病仍是quanshijie范圍內(nèi)死亡的主要原因。當(dāng)遭受心臟疾病時，心肌細(xì)胞（CMs）會被瘀痕組織替換，瘀痕組織不能完成收縮，因此不能參與泵血，導(dǎo)致剩余健康心肌組織壓力增大，最終導(dǎo)致心力衰竭。在低等脊椎動物如蠑螈和斑馬魚中，心肌細(xì)胞能夠高效的再生受損心臟。但是，在哺乳動物中，有絲分裂后的成熟心肌細(xì)胞對受損組織的修復(fù)能力有限，再生和修復(fù)損傷能力只能持續(xù)到出生的時候，此后，這種能力便會yongjiu消失。有趣的是，在新生小鼠中，心肌細(xì)胞增殖在出生一周之內(nèi)足以修復(fù)心臟損傷，這一周的時間可以給科學(xué)家提供一個時間窗口來探究促進(jìn)心臟再生的線索。
今天，與大家分享一篇2017年由以色列威茲曼科學(xué)研究院的Eldad Tahzor 教授發(fā)表在Nature（IF=40.137）上的文章《The extracellular matrix protein Agrin promotes heart regenerationin mice》，作者發(fā)現(xiàn)新生小鼠心臟中的聚集蛋白(Agrin)似乎可以控制心肌細(xì)胞的再生過程。當(dāng)將其注射到遭受心臟病發(fā)作的成年小鼠心臟中時，Agrin可以開啟心肌細(xì)胞再生功能，修復(fù)受損心肌細(xì)胞。
圖1 小鼠心臟ECM介導(dǎo)的CMs增殖中Agrin的篩選鑒定
首先，為了研究細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在心臟再生中的作用，作者選取新生小鼠（P1）和一周大（P7）的小鼠的ECM開展實(shí)驗(yàn)：將ECM中的細(xì)胞去除，僅留下基質(zhì)，將其分別加入到體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，對心肌細(xì)胞Ki67指標(biāo)進(jìn)行檢測。得出新生小鼠的ECM更容易使心肌細(xì)胞增殖（圖1 a-d），且以MMP依賴的方式進(jìn)行誘導(dǎo)（圖1 e-h）。通過質(zhì)譜方法確定新生小鼠（P1）和一周大（P7）的小鼠的ECM中主要區(qū)別成分為Agrin，這種物質(zhì)促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。通過RNA、Western blot和免疫熒光分析進(jìn)一步驗(yàn)證了新生小鼠（P1）ECM中Agrin含量更高（圖1 i-k）。另外，還通過實(shí)驗(yàn)證明了Agrin可以在體外促進(jìn)CM增殖（圖1l）。
圖2 Agrin延緩新生小鼠CMs成熟，是新生小鼠手術(shù)切除后心臟再生所必需的
通過雜交手段，構(gòu)建Agrin基因缺失的小鼠cKO（圖2a）。對Agrin-cKO小鼠心臟中Agrin蛋白和mRNA表達(dá)的分析證實(shí)了等位基因被有效地刪除（圖2b-d）。Agrin-cKO-CMs的肌節(jié)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出更成熟的狀態(tài)，肌節(jié)α-肌動蛋白和T-小管標(biāo)記物定位效果增強(qiáng)（圖2e）。同樣，在Agrin-cKO心臟中，通過western blot（圖2f）和線粒體標(biāo)記物Tom20（圖2g）染色對Myh6/Myh7比率的量化顯著提高。P1 Agrin-cKO心臟切片顯示橫紋肌節(jié)染色增加，CMs細(xì)胞周期活性降低（圖2h，i）。這些現(xiàn)象表明，Agrin在新生小鼠期會起到抑制CM成熟的作用（圖2e-g）
最后，檢測Agrin-cKO小鼠心臟再生是否受損。P1小鼠接受心臟切除術(shù)，并在1周和4周后進(jìn)行評估（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5i）。采用Masson三色染色的組織學(xué)檢查顯示，相對于野生型小鼠，Agrin-cKO小鼠的纖維化程度升高（圖2j-l），與心功能降低一致（圖2m，n）。相應(yīng)地，在Agrin-cKO心臟，CMs增殖減少（圖2o，p）。綜上所述，這些結(jié)果表明Agrin對于新生小鼠心臟再生是必要的，但對于出生后心臟的生長和維持并不是嚴(yán)格要求的。
圖3 Agrin誘導(dǎo)成年小鼠心臟再生
接著研究了重組Agrin是否能促進(jìn)成年小鼠CMs的增殖和心臟再生（圖3）。單次向心肌內(nèi)注射Agrin（50μL,20μg/mL），PBS作為對照。Agrin處理可誘導(dǎo)鄰近于幼年心臟和成年心臟梗死區(qū)健康心肌中的CMs重新進(jìn)入細(xì)胞周期（圖3a-c）。心肌梗死后4天的成年小鼠心臟組織學(xué)分析顯示，兩組受損區(qū)域相似，但從第14天開始，Agrin處理心臟瘢痕組織面積減少，到第35天顯著減少（圖3d、e）。此外，Agrin處理可以改善心肌梗死后的心功能，這兩種模型的超聲心動圖都很明顯（圖3f、g）。與對照組相比，Agrin處理的小鼠還表現(xiàn)出壁厚的保留和對擴(kuò)張型心肌病的保護(hù)作用（圖3h）。
圖4 Agrin通過Dag1、ERK和Yap信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)CM增殖
Dag1在P1心臟中廣泛表達(dá)，然而到P8，其mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)jinxian于CMs（圖4a-c）。Agrin處理后在P7心肌細(xì)胞培養(yǎng)中觀察到短暫的ERK激活（圖4d）。添加IIH6C4（一種針對Dag1-Agrin結(jié)合位點(diǎn)的阻斷抗體）降低了Agrin誘導(dǎo)的ERK激活（圖4e）。此外，使用PD0325901（PD，MEK抑制劑）或抗Dag1抗體（圖4f，g）阻斷Agrin誘導(dǎo)的p7 CM增殖。在P7培養(yǎng)的CMs中，Agrin誘導(dǎo)的肌節(jié)分解（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8d）與Agrin治療后*失去心肌肌鈣蛋白T表達(dá)的CMs數(shù)量增加2.5倍一致（圖4j）。Dag1能夠與Dystrophin結(jié)合形成糖營養(yǎng)不良蛋白復(fù)合物（Dystrophin-glycoprotein complex，DGC）。為了研究Agrin-DGC與信號分子Yap之間的聯(lián)系，用抗Syntorphin抗體對免疫沉淀DGC蛋白進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并對復(fù)合物和Yap進(jìn)行了印跡。DGC組分的Co-IP證實(shí)Agrin和Yap都會與DGC結(jié)合（圖4k-l）。經(jīng)過Agrin處理后，CMs中核Yap的百分比增加了3-4倍（圖4m）。并且，Agrin在Verteporfin（Yap-TEAD轉(zhuǎn)錄活性抑制劑）存在下未能誘導(dǎo)CM增殖（圖4n）。這一結(jié)果暗示了在Agrin誘導(dǎo)的CM增殖過程中Yap相關(guān)的信號機(jī)制。綜上所述，生化分析表明，Agrin通過Dag1與DGC結(jié)合并降低其穩(wěn)定性，隨后導(dǎo)致肌原纖維分解和下游信號分子（包括Yap和ERK）的激活。
圖5 Agrin促進(jìn)hiPSC-CMs增殖并減弱其成熟
研究Agrin能否促進(jìn)人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（hiPSC-CMs）在明膠涂層2D基質(zhì)上的增殖。人或大鼠細(xì)胞活性周期與Agrin呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系（圖5a，b）。為了探討Agrin是否能抑制hiPSC-CMs的成熟過程，采用3D貼片培養(yǎng)系統(tǒng)，分析了Agrin對hiPSC-CMs增殖和結(jié)構(gòu)和功能成熟的影響。長時間給藥處理（100 ng/ml，兩周）可促進(jìn)CMs周期活性增加2倍（圖5c）。此外，Agrin處理的CMs表現(xiàn)出成熟延遲，主要表現(xiàn)為傳導(dǎo)速度降低（圖5d），一系列功能性和成熟性標(biāo)記的表達(dá)顯著降低（圖5e，f）。綜上所述，與對小鼠的研究結(jié)果一致，Agrin促進(jìn)了hiPSC-CMs在二維和三維培養(yǎng)系統(tǒng)中的增殖并減弱其成熟。
總結(jié)
文章揭示了Agrin作為新生小鼠ECM的一個重要組成部分，是新生小鼠心臟再生bukequeshao的成分。在體外，重組的Agrin分解DGC，并通過Yap和ERK介導(dǎo)的信號途徑，誘導(dǎo)促進(jìn)小鼠和人類多功能干細(xì)胞重新分化出心肌細(xì)胞。通過單次皮下注射Agrin到小鼠體內(nèi)，也可以促進(jìn)心肌梗死的成年小鼠的心臟再生。同時，Agrin也可以促進(jìn)了hiPSC-CMs在二維和三維培養(yǎng)系統(tǒng)中的增殖并減弱其成熟。盡管該模型中觀察到的CMs增殖程度表明還會有其他的作用機(jī)制，但這項(xiàng)研究結(jié)果得出ECM的成分可以促進(jìn)心臟的修復(fù)，其中Agrin處理顯示出作為一種相對安全有效的修復(fù)哺乳動物受損心臟的藥物的潛力。Agrin的發(fā)現(xiàn)將有助于CMs再生生物醫(yī)學(xué)進(jìn)一步的研究。
在該研究中，細(xì)胞成像技術(shù)在hiPSC-CMs的組織學(xué)分析中起到了至關(guān)重要的作用，一臺能夠迅速對多孔位細(xì)胞樣品進(jìn)行快速高通量測試的儀器可讓研究工作達(dá)到事半功倍的效果。
來自英國Plexithermo的HCells高通量單細(xì)胞、器官功能測量及納米水凝膠3D培養(yǎng)系統(tǒng)：可針對單個細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞張縮力、張縮速度、張縮功率、離子濃度變化、細(xì)胞運(yùn)動軌跡，方向和頻率，以及速度或距離量化等進(jìn)行批量測量，達(dá)到每小時300個以上單細(xì)胞的數(shù)據(jù)采集，真正實(shí)現(xiàn)高通量單細(xì)胞采集。
采集數(shù)據(jù)包括多種單細(xì)胞力學(xué)指標(biāo)：測細(xì)胞收縮的速度和細(xì)胞力度、細(xì)胞大小、面積、真正產(chǎn)生的功率，收縮時的角度x軸y軸，產(chǎn)生的速度差和力差等。此系統(tǒng)的全自動設(shè)計，測試一輪后，可以定位回到同一個細(xì)胞重復(fù)測量細(xì)胞的狀態(tài)或者不同的處理?？梢蚤L期培養(yǎng)后，不同時間對同一個細(xì)胞進(jìn)行測試。測量對象可以是貼壁細(xì)胞，如成年大鼠，成年小鼠，人源干細(xì)胞。高通量單細(xì)胞功能檢測系統(tǒng)能夠從細(xì)胞微觀水平到組織宏觀水平評估各種各樣的運(yùn)動范圍、細(xì)胞運(yùn)動軌跡、單個細(xì)胞力、硬度及離子濃度，如一個孔內(nèi)一個小時測300個以上單細(xì)胞的收縮和離子濃度快速變化。
1、心肌細(xì)胞
采用超速成像納米水凝膠技術(shù)。保證藥物一定濃度水平下批量測心肌細(xì)胞的力學(xué)指標(biāo)和離子濃度變化。測細(xì)胞收縮的速度和細(xì)胞力度、細(xì)胞大小、面積、真正產(chǎn)生的功率，收縮時的角度x軸y軸，產(chǎn)生的速度差和力差等，并且可以模擬器官硬度。通過軌跡分析選擇跟蹤區(qū)域和運(yùn)動方向。軟件對遷移單元的速度或距離進(jìn)行量化?？梢苑治黾?xì)胞運(yùn)動的頻率。細(xì)胞跟蹤檢測軌跡并提供定量數(shù)據(jù)跟蹤功能還可以分析面積、周長和圓度等參數(shù)，使軟件能夠跟蹤形狀變化，例如體外心肌細(xì)胞。
2、細(xì)胞遷移和精子運(yùn)動軌跡
跟蹤函數(shù)檢測細(xì)胞軌跡，并可以計算定量數(shù)據(jù)，例如：作為軌跡（xy圖表），距離和速度。這使得系統(tǒng)具有檢測和測量功能，例如細(xì)胞遷移和精子運(yùn)動的軌跡。
3、動態(tài)跟蹤可以分析細(xì)胞增殖的變化，如菌落形成。
4、人iPS細(xì)胞衍生神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞活力測定：
可以測量神經(jīng)元的運(yùn)動。神經(jīng)元運(yùn)動的功率譜密度（PSD）可用于準(zhǔn)確預(yù)測細(xì)胞死亡。PSD表示一個單元在頻域中的運(yùn)動強(qiáng)度。神經(jīng)元培養(yǎng)的PSD比傳統(tǒng)的生存能力測量更精確地預(yù)測細(xì)胞死亡。
5、核跟蹤特征可用于分析癌細(xì)胞遷移。
測量對象：癌細(xì)胞、斑馬魚、精子、菌落、貼壁細(xì)胞（如：急性分離的成年小鼠細(xì)胞，乳鼠細(xì)胞、成年大鼠的心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、
參考文獻(xiàn):
Elad Bassat, Yara EidMutlak, Alex Genzelinakh et al. The extracellular matrix protein Agrin promotesheart regeneration in mice. Nature, Published online 05 June 2017,doi:10.1038/nature22978
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