【中文題目】小鼠棕色和白色脂肪細胞翻譯圖譜分析，鑒定代謝相關的小開放閱讀框和功能性微蛋白

【文章題目】Profiling Mouse Brown and White Adipocytes to Identify Metabolically Relevant Small ORFs and Functional Microproteins

【發(fā)表期刊】Cell Metabolism（Q1，IF 27.7）

【發(fā)表年份】2023年

【研究團隊】美國西雅圖諾和諾德研究中心Christopher A. Barnes團隊和美國索爾克生物研究所Alan Saghatelian團隊共同合作

【研究技術】核糖體印跡測序（Ribo-Seq）和蛋白質組學（DIA-MS）組合

【研究概要】本文利用Ribo-Seq分析了小鼠棕色、白色和米色脂肪細胞中的短開放閱讀框（smORFs）和微蛋白（MPs），鑒定到未注釋的、具有MP編碼潛力的smORF 共3877個。通過蛋白質組學驗證，其中85個MP被確認具有功能性，包括33個在血漿中循環(huán)的MP。進一步分析發(fā)現，許多MP在高脂飲食等生理條件下受到調節(jié)，并與已知的代謝基因呈現共表達。此外，Ribo-Seq 還提供了 Gm8773 翻譯的證據，該基因編碼一種與人類和雞FAM237B同源的分泌微蛋白。Gm8773 在下丘腦弓狀核中高度表達，向肥胖小鼠腦室內注射重組mFAM237B會引起食欲增加。這表明脂肪細胞MP數據庫對于研究參與基本代謝和生理過程的代謝調節(jié)因子具有重要價值。

近年來，隨著核糖體圖譜分析和質譜技術的快速發(fā)展，越來越多的微蛋白被鑒定出來，這不僅拓展了人們對蛋白質的理解，也為生命科學研究開辟了一個新方向。研究證明，許多微蛋白在細胞應激、肌肉發(fā)育和代謝調控中發(fā)揮重要作用，然而，微蛋白的鑒定以及功能研究還有待深入發(fā)掘。脂肪組織不僅是能量儲存器官，還是一種內分泌器官，能夠分泌多種代謝調節(jié)因子（如瘦素、脂聯(lián)素）以調節(jié)攝食、能量平衡和產熱。許多的微蛋白具有代謝調節(jié)功能，這提示微蛋白可能是代謝調節(jié)劑的豐富來源。肥胖和代謝疾病的高發(fā)，使得挖掘新的代謝調控因子尤為重要。

研究結果

1.采用Ribo-seq技術鑒定小鼠脂肪細胞中新型微蛋白編碼基因

為排除脂肪組織中多種細胞類型的干擾，本研究采用原代小鼠棕色、白色和米色脂肪細胞，通過Ribo-Seq技術鑒定出3,877個未被注釋的小開放閱讀框。其中，246個在三種脂肪細胞中共同表達，926個在至少兩種細胞中表達。這些smORF的長度分布和氨基酸使用頻率與人類細胞中觀察到的微蛋白特征高度一致。

smORF分類：包括5’ UTR中的上游ORF（1,816個）、3’ UTR中的下游ORF（568個）、內含子區(qū)域（947個）及非編碼RNA/基因間區(qū)域（536個）。uORFs可能調控下游主開放閱讀框的翻譯，如代謝相關基因（如Insr、Igf1、Cd36、Ucp1等）中的uORFs，進一步分析發(fā)現這些含uORF的基因顯著富集于脂質代謝、線粒體組織等代謝相關通路。微蛋白分類：預測含有跨膜結構域的MP有84個，具有信號肽的分泌型MP有183個，其中27個同時具備兩種特征。進化保守性：204個smORF在哺乳動物中高度保守，273個小鼠smORF與人類具有高度序列相似性，提示其潛在功能的重要性。組織分布：122個含smORF的轉錄本在脂肪組織中特異性表達，提示其在脂肪生物學中可能發(fā)揮重要作用。

圖1. Ribo-seq鑒定脂肪組織中的smORF和MP

2.蛋白質組學驗證微蛋白表達

采用DIA-MS和DDA-MS聯(lián)合策略，在原代脂肪細胞裂解液及條件培養(yǎng)基中驗證了多個微蛋白的表達。其中，Gm14023-MP和CELF2-MP在棕色與白色脂肪細胞間存在顯著差異。該方法為短肽的精準定量提供了高靈敏度的工作流程。

圖2. DIA-MS工作流程

3.小鼠和人類mRNA中的uORF啟示

Pten是一個已知的腫瘤抑制因子，可促進BAT中的Ucp1表達升高，在小鼠中的高表達可改善脂肪組織代謝和整體代謝健康。小鼠與人類Pten基因均含有保守的uORF，可編碼一個由45個氨基酸組成的MP，提示其可能兼具翻譯調控與獨立功能。

PPAR-δ是一種重要的核受體，在維持能量平衡方面具有廣泛的作用，而Ppar-δ基因敲除小鼠的代謝活性較低，葡萄糖不耐受。小鼠與人類PPAR-δ基因都含有uORF，雖然序列不保守，但均被翻譯，提示uORF本身的存在而非編碼序列可能是翻譯調控的關鍵。

總之，Pten和Ppar-δ基因均含有功能性uORF，且可翻譯成微蛋白的例子，為進一步研究uORF和MP功能提供了有趣的啟發(fā)。

圖3. 肥胖小鼠模型中smORF表達呈顯著差異

4.肥胖小鼠模型中smORF表達顯著改變

在高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型中，多個脂肪組織中的smORF表達發(fā)生顯著變化，并與脂代謝、線粒體功能等通路相關。PCA分析顯示，smORF表達譜可有效區(qū)分不同脂肪組織類型及代謝狀態(tài)。共表達網絡分析進一步揭示，多個smORF與代謝關鍵基因（如Lpl、Adipoq、Ghr）協(xié)同表達，提示其可能參與能量代謝調控、胰島素敏感性、能量平衡等生理過程。

圖4. 脂肪中的smORFs與代謝相關基因呈現共表達

5.在血漿中檢測到循環(huán)的微蛋白

通過DIA-MS分析不同月齡肥胖與瘦鼠的血漿蛋白質組，共檢測到33個循環(huán)微蛋白。其中，AW112010-MP被證實為循環(huán)因子，FRS2 uORF-MP在老年肥胖小鼠血漿中顯著上調，提示其可能作為代謝相關生物標志物。

圖5. 老年肥胖小鼠血漿蛋白質組學分析

6.Gm8773編碼促食欲的神經分泌微蛋白FAM237B

Ribo-Seq證實Gm8773在脂肪細胞中翻譯，編碼一個由132個氨基酸組成的分泌型微蛋白，與雞和人的FAM237B同源（神經分泌蛋白GM，簡寫NPGM）。原位雜交顯示其在下丘腦弓狀核高表達，并與NPY神經元共定位（促食欲神經元）。腦室內注射重組mFAM237B可顯著促進肥胖小鼠攝食，揭示了Gm8773作為促食欲因子在攝食調控中的作用。

圖6. 小鼠中微蛋白Gm8773的表達、定位和功能驗證

研究小結

本研究通過多組學策略鑒定了小鼠脂肪細胞中大量未被注釋的smORF及其編碼的微蛋白，揭示了其在代謝調控中的潛在重要功能。特別是Gm8773/FAM237B的發(fā)現，為攝食行為的神經調控提供了新的分子靶點。然而，該研究還存在一些局限性，例如：質譜對短肽檢測靈敏度有限，大量預測的微蛋白尚未被驗證；大多數微蛋白的生物學功能仍需通過基因敲除或過表達等實驗進一步驗證；Gm8773的促食欲作用目前僅基于藥理學實驗，其生理功能尚需遺傳學模型確認。

研究意義

1.建立了一套適用于短肽鑒定的高靈敏度Ribo-Seq + DIA-MS聯(lián)合策略；

2.提供了小鼠脂肪細胞smORF和微蛋白的全面數據庫，為后續(xù)功能研究奠定基礎；

3.揭示代謝相關基因中uORF的翻譯調控新機制；

4.新發(fā)現的微蛋白可作為代謝調節(jié)因子或生物標志物，為肥胖和糖尿病治療提供新靶點。

參考文獻：Martinez TF, Lyons-Abbott S, Bookout AL, De Souza EV, Donaldson C, Vaughan JM, Lau C, Abramov A, Baquero AF, Baquero K, Friedrich D, Huard J, Davis R, Kim B, Koch T, Mercer AJ, Misquith A, Murray SA, Perry S, Pino LK, Sanford C, Simon A, Zhang Y, Zipp G, Bizarro CV, Shokhirev MN, Whittle AJ, Searle BC, MacCoss MJ, Saghatelian A, Barnes CA. Profiling mouse brown and white adipocytes to identify metabolically relevant small ORFs and functional microproteins. Cell Metab. 2023 Jan 3;35(1):166-183.e11.