分子互作是生命活動的基礎，不同生物分子之間的識別、結合與調控，貫穿于基因表達、信號傳導、細胞命運決定等幾乎所有生命過程。生物分子間的相互作用（蛋白-DNA、蛋白-RNA、蛋白-蛋白）是生命科學研究的核心內容，也是揭示基因調控、蛋白功能及疾病機制的關鍵。Pull-down實驗（又稱拉下實驗）既能用于篩選未知互作分子，也可用于驗證已知分子間相互作用。根據研究對象的不同，主要分為蛋白Pull-down、DNA Pull-down和RNA Pull-down三大類。

一、蛋白Pull-down

1.1 技術簡介

蛋白Pull-down是研究蛋白-蛋白相互作用的經典體外實驗技術。常用標簽：GST、His、Halo等，其中Halo標簽因共價結合、穩(wěn)定性高、非特異性背景低的優(yōu)勢，廣泛應用于真核蛋白互作研究。

1.2 技術原理

蛋白Pull-down的原理是將已知的“誘餌蛋白"與親和標簽融合表達，利用該標簽與固相基質（如瓊脂糖樹脂或磁珠）上配體的特異性結合，將誘餌蛋白固定在基質上；再與含有潛在“獵物蛋白"的樣品（如細胞裂解液）孵育，使誘餌蛋白捕獲互作蛋白；經洗滌去除未結合的雜蛋白，洗脫獲得互作復合物，最終通過Western blot、質譜等方法鑒定獵物蛋白。

圖1 蛋白Pull-down流程圖

1.3 技術優(yōu)勢

l 無需針對靶蛋白的特異性抗體，直接驗證體外蛋白互作；

l Halo Tag標簽與磁珠共價結合，顯著降低非特異性結合背景。

1.4 常用標簽及表達系統(tǒng)

二、DNA Pull-down

2.1 技術簡介

DNA Pull-down是研究DNA-蛋白質相互作用的體外實驗技術，主要用于轉錄調控機制研究。該技術以特定DNA序列為探針，從細胞核蛋白中篩選并鑒定能夠與DNA結合的蛋白，如轉錄因子、轉錄調控蛋白等。

2.2 技術原理

DNA Pull-Down使用標記的DNA探針作為誘餌，與提取的內源細胞核蛋白進行孵育，捕獲與DNA探針特異性結合的蛋白（比如轉錄因子），最終使用蛋白質譜的方法，鑒定出特異性結合的蛋白。

圖2 DNA Pull-down流程圖

2.3 技術優(yōu)勢

l 可富集低豐度DNA結合蛋白。

l DNA探針制備簡便，無需構建復雜文庫，直接體外驗證結合。

三、RNA Pull-down

3.1 技術簡介

RNA在基因表達調控中發(fā)揮重要作用，非編碼RNA（lncRNA、circRNA、miRNA）是當前研究熱點。RNA與蛋白的相互作用是非編碼RNA發(fā)揮功能的核心機制。RNA Pull-down是檢測RNA-蛋白互作的核心體外技術，主要用于篩選與驗證RNA結合蛋白（RBPs）。

3.2 技術原理

RNA Pull-Down根據目標 RNA 序列設計特異性 DNA 模板，通過體外轉錄制備標記 RNA 探針；先將標記探針與鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)，制備固定有 RNA 探針的磁珠復合物，再與細胞蛋白提取液共孵育，捕獲能與 RNA 探針特異性結合的蛋白并形成 RNA-蛋白質復合物。經洗滌去除非特異性結合蛋白、完成富集后，對富集蛋白進行LC?MS/MS 質譜分析，即可鑒定出與目標 RNA 特異性互作的蛋白質。

圖3 RNA Pull-down流程圖

3.3 技術優(yōu)勢

l 靈敏度高，可富集低豐度RNA結合蛋白。

l 可直接篩選與目標RNA結合的蛋白。

四、三種Pull-down實驗應用場景

五、常見問題解答

Q1：我的研究部位可以跟實驗所用部位不一致嗎？

建議使用與研究目標一致的組織樣本，以保證結果可靠性。

Q2:我需要提供哪些材料？

DNA Pull-down與RNA Pull-down需要提供探針序列/模板及組織等材料。

蛋白Pull-down需要提供蛋白CDS序列/質粒模板及組織等材料。

Q3：結果交付結果包含哪些信息？

質譜原始數據，實驗原圖，質譜差異分析及富集分析等全套數據。

Q4：強結合蛋白更容易鑒定到嗎？

不一定，結果受蛋白豐度、洗滌條件、質譜靈敏度影響。建議篩選后針對性驗證。

Q5：蛋白Pull-down和Co-IP的區(qū)別？

蛋白Pull-down不依賴靶蛋白特異性抗體，體外驗證蛋白直接相互作用；Co-IP依賴靶蛋白特異性抗體，在細胞生理內源環(huán)境下驗證蛋白直接或間接相互作用。

蛋白、DNA、RNA三大Pull-down快速選擇：

? 看蛋白互作→蛋白Pull-down

? 看轉錄調控→DNA Pull-down

? 做非編碼RNA/RNA結合蛋白→RNA Pull-down