夾心 ELISA 測定兩層抗體（捕獲抗體和檢測抗體）之間的抗原。目標(biāo)抗原必須包含至少兩個(gè)能夠結(jié)合到抗體的抗原表位。單克隆或多克隆抗體均可在夾心 ELISA 系統(tǒng)中用作捕獲抗體和檢測抗體。單克隆抗體識別單一表位，可對抗原中微小差別進(jìn)行定量檢測。多克隆抗體通常用作捕獲抗體以沉降盡可能多的抗原。夾心 ELISA 省去了分析之前的樣品純化步驟，而且提高了分析靈敏度（靈敏度比直接或間接 ELISA 高 2-5 倍）。

封閉和加樣過程：

1.       每孔添加 200 μL 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。

2.       用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少 1-2 小時(shí)，或在 4 ℃ 下孵育過夜。

3.       用 200 µL PBS 洗滌微量滴定板兩次。

4.       每孔添加 100 μL 經(jīng)過稀釋的樣品。通常將未知樣品的信號與標(biāo)準(zhǔn)曲線的信號進(jìn)行比較。每個(gè)板都必須測定標(biāo)準(zhǔn)品（兩重測定或三重測定）和空白樣。在 37 ℃ 下孵育 90 分鐘。
確保標(biāo)準(zhǔn)品的濃度涵蓋抗體結(jié)合的大部分動態(tài)檢測范圍。可能需要優(yōu)化濃度范圍以確保獲得合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品通常采取兩重測定或三重測定。

5.       棄去樣品，用 200 μL PBS 洗滌微量滴定板兩次。