PCR基因擴增技術特點匯集

時間：2025/7/8閱讀：360

基因擴增技術(PCR)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction簡稱PCR)又稱無細胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法，是基因擴增技術的一次重大革新。

PCR的特點：

　　一、特異性高

　　報導的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段，同時引物是在37℃延伸(聚合)易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時不被滅活，不必在每次循環(huán)擴增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性，序列分析證明其擴增的DNA序列與原模板DNA一致。擴增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。

　　二、高度敏感

　　理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴增DNA十億倍以上，實際應用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞，或對諸如病人口液等只含一個感染細胞的標本或僅含0.01pg的感染細胞的特異性片段樣品中均可檢測。

　　三、快速及無放射性

　　一般在2小時內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴增，加上用電泳分析。只需3-4小時便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗制品及總RNA均可作為反應起始物，可直接用臨床標本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發(fā)、細胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來擴增檢測，省去費時繁雜的提純程序，擴增產(chǎn)物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無放射性易于推廣。

　　四、簡便

　　擴增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規(guī)方法中須先進行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構建一個內(nèi)切酶位點，擴增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應酶切位點的載體中。

　　五、可擴增RNA或cDNA

　　先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉錄酶將mRNA轉變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進行PCR擴增，即使mRNA轉錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經(jīng)PCR擴增1ng有242堿基對長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難以將整段DNA大分子擴增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對外顯子的擴增并進行序列分析。

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