【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：大腸桿菌O157:H7核酸快速檢測試劑盒

英文名稱：Rapid Detection kit for E. coli O157: H7

【包裝規(guī)格】24測試/盒

【產(chǎn)品編號】KJD09L

【產(chǎn)品簡介】

本試劑盒基于環(huán)介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，用于食品中大腸桿菌O157:H7的快速檢測，可借助顯色指示劑直接判讀結(jié)果。

【檢測原理】

利用兩對特殊引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，使模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，引物順利與模板結(jié)合并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下(60-65℃)進(jìn)行連續(xù)快速擴(kuò)增。反應(yīng)加入顯色指示劑，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，可直接通過顏色變化判讀結(jié)果。

【產(chǎn)品特點(diǎn)】

1. 快速簡便：將酶、引物等反應(yīng)組分混勻后進(jìn)行干粉化處理，增加試劑穩(wěn)定性，使用時減少溶液配制步驟，更為便捷，整個檢測反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成；

2. 特異性高：利用靶基因序列上的多個獨(dú)立區(qū)域設(shè)計多條引物，保證擴(kuò)增反應(yīng)的高度特異性;

3. 靈敏度高：檢驗限達(dá)到29 CFU/Test；

4. 判讀簡單：反應(yīng)前加入顯色指示劑，反應(yīng)后通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化或者經(jīng)熒光監(jiān)測儀器跟蹤熒光圖譜的變化判讀結(jié)果，直觀方便，且可有效避免反應(yīng)后開蓋造成的氣溶膠污染。

【產(chǎn)品組分】

組分名稱　　　　　規(guī)格×數(shù)量

檢測試劑（凍干）   3排× 8管

復(fù)溶液　　　　 　   650 μL × 1管、

陽性對照（凍干）   1管

陰性對照（凍干）   1管

裂解液　　　 　     1 mL × 1管

顯色指示劑　　　   80 μL×1管

超純水                  1 mL×1管
說明書1份

2~8℃條件下儲存，有效期為12個月、

【適用儀器】

1. PCR儀器或金屬浴恒溫器，如果檢測樣品為DNA樣品，水浴鍋即可。

2. 高速離心機(jī)，樣品的前處理需要用高速離心機(jī)做分離。

【樣品富集】

1. 樣品前處理：取25g待檢樣品置于225 mL mEC肉湯中，前增菌10-12 h，對增菌液中的菌體富集用于LAMP快速檢測。

2. 適用樣品類型：增菌液或者可疑菌落樣品。

3. 待測樣品存放：粗提的待檢DNA樣品保存于-4~0℃，不應(yīng)該超過24 h;利用試劑盒提取的DNA樣品可在-20℃長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

【使用指南】

1. 樣品前處理

A. 樣品增菌液模板DNA的制備：

a) 在檢測食品中大腸桿菌O157:H7時，吸增菌液1 mL到1.5 mL規(guī)格的無菌離心管中，6000 r/min離心5 min，棄上清;

b) 加入30 μL裂解液，充分懸浮菌體，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱10 min。

c) 12000 r/min離心15 min，上清即為粗提的DNA，可轉(zhuǎn)移至0.2 mL無菌離心管中，在-20℃下可長期保存。

B. 可疑菌落模板DNA的制備：

挑取可疑菌落，懸浮到含30 μL裂解液的無菌離心管中，后按照上述步驟b)、c)操作。

2. 陰、陽性對照和干粉試劑復(fù)溶

A. 陰、陽性對照復(fù)溶

使用時，加入80 μL超純水至陽性對照和陰性對照凍干粉中，待溶解后混勻，-20℃存儲待用。

B. 干粉試劑復(fù)溶

取出凍干粉試劑，按照需求剪取n個檢測試劑管(n=待檢測樣品數(shù)+1管陽性對照+1管陰性對照)，每管加入20 μL復(fù)溶液，溶解后待用。

1. 擴(kuò)增反應(yīng)

A. 打開能夠提供恒溫條件的儀器，設(shè)置到64℃待用;

B. 向上述已加入復(fù)溶液的n個反應(yīng)管中各加入顯色指示劑2.5 μL；

C. 向上述已加入復(fù)溶液的n個反應(yīng)管中分別加入待測樣品核酸、陰性對照、陽性對照各2.5 μL，蓋緊蓋子;

D. 將所有的反應(yīng)管置于恒溫儀器中，反應(yīng)50 min。

2. 結(jié)果判讀

反應(yīng)結(jié)束后，建議在自然光線充足的環(huán)境條件下，將樣品置于白色背景下觀察結(jié)果，陰性對照檢測試劑管呈淡橙色，陽性對照檢測試劑管呈熒光綠，待測樣品反應(yīng)管以此作為對照進(jìn)行判讀，若陰陽對照反應(yīng)管任一結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。

【注意事項】

1. 檢測空間應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)操作，在空間條件允許情況下，試劑配置區(qū)用于配置反應(yīng)所需要的所有試劑;樣品前處理區(qū)用于待測樣品的核酸提取和模板的加入;擴(kuò)增觀察區(qū)用于反應(yīng)進(jìn)行和結(jié)果判讀。各區(qū)內(nèi)空間獨(dú)立，試驗用品專用，避免交叉污染。另外，樣品處理區(qū)建議配備超凈工作臺，并且所有步驟嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行。

2. 檢測過程中建議穿潔凈工作服，帶一次性手套，使用的槍頭需提前滅菌。

3. 干粉檢測試劑在使用前低速離心，確保所有的干粉沉在管底，加入復(fù)溶液后盡量避免產(chǎn)生氣泡，反應(yīng)前檢查反應(yīng)管是否蓋緊，避免泄露造成污染。

4. 陽性對照可能會作為污染源，污染其他試劑和待檢樣品，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果，在加樣過程中建議最后加入陽性對照反應(yīng)管。

5. 使用顯色指示劑時，在反應(yīng)結(jié)束后切忌開蓋，以防氣溶膠污染。

6. 本試劑盒僅用于食品和環(huán)境中樣品的檢測。

本試劑盒是基于核酸的分子檢測，因此并 非只能檢出大腸桿菌O157：H7活菌，判定結(jié)果有時會與傳統(tǒng)培養(yǎng)法不同，如需辨明活菌樣品存在，請用傳統(tǒng)微生物檢驗方法進(jìn)行確證。

7. 試劑盒中反應(yīng)管材質(zhì)為聚丙烯，包裝盒材質(zhì)是紙，使用完畢廢棄時按照醫(yī)療廢棄物相關(guān)規(guī)定處理，由使用者自行負(fù)責(zé)處理。

8. 不同批號的產(chǎn)品請勿混合使用，請在有效期內(nèi)使用試劑盒，由于操作不當(dāng)引起的誤判，以及有此誤判引發(fā)的其他事項，本公司概不負(fù)責(zé)。