Claycomb Medium培養(yǎng)基

產(chǎn)品介紹：

產(chǎn)品介紹

HL-1 Medium不含L-谷an酰an，液體，無菌過濾，適合細胞培養(yǎng)。

Claycomb培養(yǎng)基專用于培養(yǎng)小鼠心肌細胞生長。HL-1是第一個能夠在 體外維持分化心肌細胞表型和收縮活性的細胞系。HL-1細胞系可用于研究心肌梗塞后的心肌細胞肥大、測試新型心臟治療藥物和療法、生產(chǎn)高水平心肌蛋白以及研究成熟心肌細胞特異性基因。補充100 μM去甲腎上腺su、10％胎牛血清（FBS）和4mM L-谷an酰an的Claycomb培養(yǎng)基，將能夠維持HL-1細胞系和成熟心肌細胞的行為。在光學顯微鏡下觀察HL-1細胞時，可以觀察到細胞個體和群體的收縮隨心肌細胞逐漸融合而變得更加頻繁。

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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng):

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定:

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

運輸和保存：

運輸：放置于含有生物冰袋的保溫箱中低溫運輸

保存方法：按照對應保存條件保存12個月，配置好的培養(yǎng)基2℃～8℃,保存2個月；

質(zhì)量控制：

注意事項：

1、收到產(chǎn)品請先檢查包裝是否完好，如有破損，漏液、渾濁等現(xiàn)象請及時聯(lián)系我們，培養(yǎng)基凍融后，可能會有少量絮狀物析出，不影響產(chǎn)品正常使用。

2、請仔細閱讀產(chǎn)品說明書，了解產(chǎn)品使用方法、保存方式、有效期等信息，若因操作失誤，保存不當而導致產(chǎn)品出現(xiàn)污染等問題的，責任由客戶自行承擔。

3、本產(chǎn)品僅能用于科研，培養(yǎng)基中的一些組分對人體有較低的危害性，如有接觸立即用大量清水沖洗即可。

培養(yǎng)操作:

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細胞懸液，注意凍 存管做好標識。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

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